用于降低CHO细胞中表达重组蛋白的氧化的液体培养基制造技术

本发明专利技术提出了一种用于降低CHO细胞中表达重组蛋白的氧化的液体培养基，培养方法，及降低CHO细胞中表达重组蛋白的氧化的方法。该液体培养基包括：基础培养基、补料培养基和米诺地尔。该培养基中添加米诺地尔，有效降低了融合蛋白及抗体类药物在CHO细胞中的合成过程所形成的氧化杂质，而且不影响融合蛋白及抗体类药物的合成及其质量属性，成本低，操作简单，适合工业化大生产。

【技术实现步骤摘要】
用于降低CHO细胞中表达重组蛋白的氧化的液体培养基
本专利技术属于生物学
，具体地，本专利技术涉及CHO细胞液体培养基、CHO细胞培养方法，及用于降低CHO细胞中表达重组蛋白的氧化的方法。
技术介绍
单克隆抗体和其它生物药已被广泛用于肿瘤、炎症、代谢疾病等的治疗，并取得了很好的疗效。基于生物药结构的复杂性，其通常需要在生物宿主内合成。用于重组mAb或融合蛋白类药物表达的宿主细胞系有CHO、NS0、Sp2/0、HEK293和PER.C6等。因CHO细胞在蛋白合成过程中具有与人类蛋白相似的翻译后修饰，且易适应无血清培养基，可在限定培养基中悬浮生长，促进了生物工艺的改进放大，并且已证明其可作为可靠的安全宿主，因此重组蛋白药物生产过程中最常用CHO作为宿主细胞。CHO细胞在蛋白合成过程中，蛋白产物的合成情况除与克隆本身有关外，与其培养条件密切相关。蛋白合成过程中的翻译后修饰对其生物活性及稳定性等至关重要。蛋白合成过程中，常见的翻译后修饰有氧化，磷酸化、脱氨、C-端的切除、糖基化等。氨基酸的氧化会改变生物大分子的二级、三级结构，从而可能导致其生物活性的改变，半衰期的缩短，形成聚集体等。蛋白合成过程中由于相关酶的催化作用或细胞代谢所产生的活性氧的作用而将氨基酸残基氧化形成氧化杂质。HazeltineLB等人研究发现通过调整培养基中锰离子，铜离子，半胱氨酸及色氨酸浓度可降低色氨酸氧化(BiotechnolProg,2016)，同时YunZ等人研究发现添加谷胱甘肽和铁离子螯合剂可降低胞内的活性氧水平(JBiosciBioeng,2003)。还有文献报道添加硫辛酸、甲硫氨酸、N-乙酰半胱氨酸及半胱氨酸可调整细胞内的活性氧水平，从而减少蛋白的氧化(ExpToxicolPathol,2008)。HouY等人在2019年的BiotechnolJ杂志上发表了其最新研究：通过增加培养基中烟酰胺、半胱氨酸的浓度，可缓解蛋白合成过程中的赖氨酸的羟基化。这些方法或多或少会对产物的表达或其质量属性产生影响，如培养基中加金属离子会降低氧化，但同时也会改变培养基的pH和渗透压进而影响细胞的生长。
技术实现思路
本申请是基于专利技术人对以下事实和问题的发现和认识作出的：现有技术中融合蛋白及抗体类药物在CHO细胞中的合成过程容易形成氧化杂质。基于上述问题的发现，专利技术人提出一种用于降低CHO细胞中表达重组蛋白的氧化的液体培养基，发现CHO细胞培养过程中在培养基中添加米诺地尔可在不影响细胞生长及产物合成、不影响目的产物的其它质量属性的情况下降低氧化杂质，且在培养基及细胞克隆变化时依然对融合蛋白及抗体类药物的氧化杂质具有降低效果。本专利技术适于解决融合蛋白及抗体类药物在CHO细胞中的合成过程所形成的氧化杂质问题。在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种用于降低CHO细胞中表达重组蛋白的氧化的液体培养基。该培养基包括培养基添加物，所述培养添加物为米诺地尔，所述液体培养基能够降低蛋白合成中氧化杂质的形成。在一些实施例中，所述液体培养基还包括基础培养基和补料培养基。在一些实施例中，将米诺地尔配成母液，在细胞接种0-10天内一次性添加或在培养过程中分阶段多次添加。在一些实施例中，本专利技术所述米诺地尔的使用浓度为0.1-1mM。在一些实施例中，本专利技术所述米诺地尔的使用浓度为0.6mM。在一些实施例中，本专利技术所述米诺地尔的使用浓度为0.3mM。在一些实施例中，本专利技术所述基础培养基为Dynamis或EXCELLAdvancedCHOmedium；所述补料培养基为CellBoost或EXCELLAdvancedFeed1。在一些实施例中，本专利技术所述基础培养基为Dynamis；所述补料培养基为CellBoost。在一些实施例中，本专利技术所述基础培养基为EXCELLAdvancedCHOmedium；所述补料培养基为EXCELLAdvancedFeed1。在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种利用本专利技术所述液体培养基对CHO细胞进行培养的方法。根据本专利技术实施例的培养方法，培养基中添加米诺地尔可以降低目的蛋白或单抗中氨基酸的氧化，降低氧化杂质的含量，而且不会对目的蛋白或单抗的表达量、糖型、电荷异质性等其他属性造成明显影响。在一些实施例中，利用所述液体培养基对CHO细胞进行培养，以便获得氧化杂质少的融合蛋白或单抗。所述培养工艺为分批培养、补料分批培养或灌流培养。所述培养是在三角瓶、搅拌式反应器或波浪式反应器中，温度为30-37℃条件下进行。在一些实施例中，进行所述培养之前，进一步包括将所述CHO细胞接种于所述基础培养基。在一些具体的实施例中，所述接种量为0.2～1.2*106个/mL。上述接种密度下，更适合CHO细胞的生长和目的产物的合成。在一些实施例中，所述融合蛋白为Fc融合蛋白。在一些具体的实施例中，所述融合蛋白为GLP-1的Fc融合蛋白。在一些具体的实施例中，所述单抗为阿达木单抗。在本专利技术的第三方面，本专利技术提出了所述培养基或培养方法在降低融合蛋白及抗体类药物氧化杂质上的应用。在本专利技术的第四方面，本专利技术提出了一种用于降低CHO细胞中表达重组蛋白的氧化的方法，所述方法为在细胞培养过程中添加米诺地尔，或者利用本专利技术所述培养基或培养方法培养CHO细胞。详细说明本专利技术将会把确定的具体化的内容所对应的文献详细列出。本专利技术有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物，这些可能如权利要求所定义的那样包含在现有专利
所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法和物质，这些可以应用于本专利技术的实践中去。本专利技术绝非限于方法和物质的描述。有很多文献和相似的物质与本专利技术申请相区别或抵触，其中包括但绝不限于术语的定义，术语的用法，描述的技术，或如本专利技术申请所控制的范围。本专利技术所使用的“LC-MS胰蛋白酶图谱分析”为将液质联用应用于研究蛋白质的技术，其分析原理为在变性条件下向分析样品中加入还原剂，打开融合蛋白内部所有交联的二硫键,再加入烷基化试剂封闭所有的自由巯基，使融合蛋白分子在溶液中以游离伸展肽链的形式存在。加入胰蛋白酶，将充分伸展的肽链酶解成小的肽段后进行LC-MS分析，通过分析实验组与对照组样品各肽段的分子量差异来检测氧化杂质的含量和糖型。本专利技术所使用的“ProteinA”是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，分子量42KD，天然的ProteinA有5个IgG结合结构域和未知功能的非Fc结合域。结合域能够特异性地结合多种免疫球蛋白的Fc区段而与Fab区或轻链结合很弱。非Fc结合域能结合部分杂蛋白，导致洗脱下来的IgG纯度不够。因此，现实中，多使用的是重组型ProteinA，其非特异性结合明显降低。本专利技术所使用的“ProteinA亲和色谱柱”广泛用于各种抗体的柱层析分离纯化，其原理是将ProteinA与琼脂糖凝胶以一定的方式结合，制备用于抗体纯化的亲和填料，经过亲和层析，即可从腹水、血清和培养液等样品中纯化得到高纯度的抗体。检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于降低CHO细胞中表达重组蛋白的氧化的液体培养基，其特征在于，包括培养基添加物，所述培养添加物为米诺地尔，所述液体培养基能够降低蛋白合成中氧化杂质的形成。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于降低CHO细胞中表达重组蛋白的氧化的液体培养基，其特征在于，包括培养基添加物，所述培养添加物为米诺地尔，所述液体培养基能够降低蛋白合成中氧化杂质的形成。


2.根据权利要求1所述的液体培养基，其特征在于，还包括基础培养基和补料培养基；所述基础培养基为Dynamis或EXCELLAdvancedCHOmedium；所述补料培养基为CellBoost或EXCELLAdvancedFeed1。


3.根据权利要求1所述的液体培养基，其特征在于，将所述米诺地尔配成母液，在细胞接种0-10天内一次性添加或在培养过程中分阶段多次添加。


4.根据权利要求1或3任一项所述的液体培养基，其特征在于，所述米诺地尔的浓度为0.1-1mM；任选的，所述米诺地尔的浓度为0.6mM；任选的，所述米诺地尔的浓度为0.3mM，任选的，所述米诺地尔的浓度为0.9mM。


5.一种CHO细胞的培养方法，其特征在于，利用权利要求1-4任一项所述的液体培养基对CHO细胞进行培养。

<...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄根树，李得林，高相雷，郭林峰，李晓平，李文佳，陈小锋，廖超，孟晓，龚庆伟，张晓焰，宁荣良，
申请(专利权)人：东莞市东阳光生物药研发有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44