一种基于阴离子交换色谱柱的SUMO化肽段的富集方法技术

本发明专利技术涉及一种基于阴离子交换色谱柱的SUMO化肽段的富集方法，包括：蛋白质碱性位点酶切、在碱性环境中通过阴离子交换色谱柱去除保留弱的酶解肽段、收集保留较强的SUMO化肽段流出液。首先对蛋白的碱性位点进行酶切，酶切后的SUMO化肽段有多个酸性氨基酸，在碱性环境中其在阴离子交换色谱柱中的保留较非SUMO化肽段更强，采用阴离子交换色谱柱先对保留较弱的酶切产物进行洗脱，最后收集保留较强的肽段组分，即为富集后的SUMO化肽段。本发明专利技术的优点是操作步骤简单方便、选择性高、富集效率高、可同时富集多类型的SUMO化肽段、提高了SUMO化修饰位点的鉴定覆盖度。

【技术实现步骤摘要】
一种基于阴离子交换色谱柱的SUMO化肽段的富集方法
本专利技术涉及SUMO化肽段的富集方法，即一种基于阴离子交换色谱柱的SUMO化肽段的富集方法，以实现复杂蛋白质样品SUMO化肽段的高效和高选择性富集。
技术介绍
泛素化修饰是生物体内常见的翻译后修饰之一，也是最早发现的一种与蛋白质相连的修饰方式，在蛋白质降解方面发挥着重要作用。近十几年来科学家们相继发现了一些类泛素蛋白，其中小泛素相关修饰物(smallubiquitin-likemodifiers,SUMO)是最受瞩目的一类。SUMO在多个细胞生理活动中都发挥着重要的调节作用，例如维持基因组稳定性、调节细胞周期、调控细胞分化和转录因子活性、参与信号转导等。许多SUMO修饰蛋白如转录因子在细胞中的丰度很低，并且在正常状态下只有小部分蛋白质底物被修饰。在进行质谱分析时，复杂样品中蛋白质的浓度范围很广，高丰度的蛋白质会对低丰度SUMO修饰蛋白质质谱信号产生抑制。此外，在对蛋白质SUMO修饰多肽(位点)进行分析时，SUMO修饰蛋白质酶解产物中大量的非修饰肽段对SUMO修饰肽段产生极大干扰。上述因素严重影响了SUMO修饰蛋白及其修饰位点的鉴定和定量效率。为了提高对SUMO修饰的鉴定效率，人们发展了多种基于生物标记的富集方法。通常是对SUMO进行His-tag标记或者变异后，利用镍柱或者抗体对SUMO修饰蛋白和多肽进行亲和富集(NatureCommunication2017,8,14109；NatureStructural&MolecularBiology2017,24,325-336；NatureCommunication2015,6,7289)。此类方法有助于提高对SUMO修饰的鉴定效率，但是只适用于基因可改变的生物样品(如细胞)，对于组织、血液等样品则无能为力；此外，对SUMO序列进行改变可能影响SUMO的性质和功能，因此无法准确反映样品中蛋白质的真实修饰状态。最近陆续发表的几篇文章已被报导可成功鉴定到人源细胞与小鼠组织中的内源性SUMO化肽段(NatureCommunication2018,9,2456；NatureCommunication2017,8,1171；Molecular&CellularProteomics2017，16，717-727)，但是仍然依赖于价格昂贵的抗体对SUMO修饰多肽进行亲和富集，且只能针对一类SUMO修饰肽段进行富集。因此，亟需发展一种普适性的用于内源型SUMO修饰蛋白质及修饰多肽的富集方法。为克服以上方法所存在的问题，建立一种高效的普适性的富集方法，我们利用碱性位点酶切后的SUMO化肽段具有多酸性氨基酸的特征，结合阴离子交换色谱实现对非SUMO化肽段的高效去除，提高SUMO化肽段富集的选择性和效率。
技术实现思路
本专利技术发展了一种基于阴离子交换色谱柱的SUMO化肽段的富集方法，操作步骤简单方便、选择性高、富集效率高为了实现该目的，本专利技术的技术方案是：1)采用酶切位点为精氨酸或赖氨酸羧基端的蛋白水解酶酶解蛋白质将蛋白质进行变性、还原、烷基化后，加入蛋白水解酶进行酶解，蛋白水解酶用量为蛋白质质量的1/5-1/100，25-45℃酶解2-48h，得到蛋白酶解物溶液；蛋白水解酶为胰蛋白酶，蛋白内切酶Lys-C，蛋白内肽酶Arg-C中的一种或二种以上。2)在碱性环境中通过阴离子交换色谱柱去除保留弱的酶解肽段，收集保留较强的SUMO化肽段流出液将蛋白酶解物溶液除盐，冻干后，采用A相溶解并上样到阴离子交换色谱柱上进行分离，流速为0.1-3mL/min，在低盐浓度流动相下洗脱除去不保留的酶解肽段，即氯化钠的摩尔浓度≤100mM时的不保留肽段；收集在高盐浓度流动相下的肽段流出液，即在氯化钠的摩尔浓度>100mM时不保留的肽段流出液，将溶液除盐，冻干，得SUMO化肽段。按体积百分浓度计，A相：5-30％乙腈+1-10mM碱性溶液；B相：5％-30％乙腈+1-10mM碱性溶液+200-1000mM氯化钠。阴离子交换色谱柱的分离梯度采用线性梯度或台阶梯度。阴离子交换色谱柱的固定相为含有季铵基和/或叔胺基化学键合的聚合物基质材料(聚丙烯酸酯类基质、聚苯乙烯类基质、聚丙烯酰胺类基质)；材料可以是颗粒材料或者整体材料；色谱柱内径为1-8mm，长度为5-30cm；调节pH至碱性环境所采用的碱性溶液为pH为8-14的碳酸氢铵缓冲盐溶液、pH为8-14的磷酸缓冲盐溶液、pH为8-14的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液、氨水、碳酸钠溶液、或氢氧化钠溶液中的一种或二种以上配置而成；缓冲液浓度为1-10mM。本专利技术的有益效果为：1、碱性蛋白酶酶切效率高，选择性好；2、阴离子交换色谱的分离能力强，促进非SUMO化肽段的高效去除；3、对不同类型的SUMO化肽段无歧视，避免SUMO化肽段的损失；本专利技术的优点是富集选择性高、富集效率高、可同时富集多类型的SUMO化肽段、提高了SUMO化修饰位点的鉴定覆盖度。附图说明图1：SUMO化肽段的富集流程；图2：胰蛋白酶酶切后的SUMO1标肽在阴离子交换色谱柱中的色谱峰(SUMO1标肽序列：ELGMEEEDVIEVYQEQTGG(19)-LLVHMGLLKSEDKVK(9))；图3胰蛋白酶酶切后的SUMO1标肽与4条普通标肽混合物在阴离子交换色谱柱中的色谱峰(4条标肽序列：LIGNFQLTGIAPAPK；LNLFTGWK；VLIAAHGNSLR；GVVGIVAGGGR)；图4：胰蛋白酶酶切后的HeLa全蛋白样品在阴离子交换色谱柱中的色谱峰。其中图4(a)为实施例6胰蛋白酶酶切后的HeLa全蛋白样品在阴离子交换色谱柱中的色谱峰；图4(b)为实施例7胰蛋白酶酶切后的HeLa全蛋白样品在阴离子交换色谱柱中的色谱峰；具体实施方式实施例1如图1所示，首先对蛋白的碱性位点进行酶切，酶切后的SUMO化肽段有多个酸性氨基酸，在碱性环境中在阴离子交换色谱中的保留较非SUMO化肽段更强，采用阴离子交换色谱先对保留较弱的酶切产物进行洗脱，最后收集保留较强的肽段组分，即为富集后的SUMO化肽段。以HeLa细胞为样品，100μg提取蛋白溶于100μl8M尿素的50mM碳酸氢铵缓冲液(pH为8)，加入10μl100mM二硫苏糖醇，56℃变性还原1h后，加入10μl300mM碘乙酰胺反应0.5h后，另加入30μl100mM二硫苏糖醇，孵育10min后，采用胰蛋白酶酶切，其中酶用量为样品质量的1/10，温度为37℃，酶解60min后，除盐，冻干，重溶于0.1％甲酸，进行质谱分析，肽段羧基端的赖氨酸和精氨酸得到了高效高选择性的剪切。实施例2以HeLa细胞为样品，100μg提取蛋白溶于100μl8M尿素的50mM碳酸氢铵缓冲液(pH为8)，加入10μl100mM二硫苏糖醇，56℃变性还原1h后，加入10μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于阴离子交换色谱柱的SUMO化肽段的富集方法，其特征在于：包括：/n1)蛋白质碱性位点酶切；/n2)阴离子交换色谱柱分离：在碱性环境中通过阴离子交换色谱柱去除保留弱的酶解肽段，收集保留较强的SUMO化肽段流出液。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于阴离子交换色谱柱的SUMO化肽段的富集方法，其特征在于：包括：
1)蛋白质碱性位点酶切；
2)阴离子交换色谱柱分离：在碱性环境中通过阴离子交换色谱柱去除保留弱的酶解肽段，收集保留较强的SUMO化肽段流出液。


2.按照权利要求1所述富集方法，其特征在于：
所述的蛋白质碱性位点酶切，具体步骤如下：
于变性、还原、烷基化后的蛋白样品溶液中加入蛋白水解酶进行酶解，蛋白水解酶用量为蛋白质质量的1/5-1/100，酶解时间为2-48h，酶解温度25-45℃，得到蛋白酶解物溶液。


3.按照权利要求1所述富集方法，其特征在于：
所述的在碱性环境中通过阴离子交换色谱柱去除保留弱的酶解肽段，具体步骤如下：
将蛋白酶解物溶液除盐，冻干后，采用A相溶解并上样到阴离子交换色谱柱上进行分离，流速为0.1-3mL/min，在低盐浓度的流动相下洗脱除去不保留的酶解肽段，即氯化钠的摩尔浓度≤100mM时的不保留肽段；
按体积百分浓度计，A相：5-30％乙腈+1-10mM碱性溶液；B相：5％-30％乙腈+1-10mM碱性溶液+200-1000mM氯化钠；
所述的收集保留较强的SUMO化肽段流出液，具体步骤如下：
在低盐浓度流动相下的不保留肽段被洗脱后，收集在高盐浓度流动相下的肽段流出液，即在氯化钠的摩尔浓度&g...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，李洋，孙明伟，单亦初，杨开广，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21