血浆阿莫西林浓度的HPLC-MS/MS检测方法技术

本发明专利技术涉及一种血浆阿莫西林浓度的HPLC‑MS/MS检测方法。包括以下步骤：(A)储备液的制备；(B)工作溶液的制备；(C)标准曲线样本和质控样本的制备；(D)样本前处理：取血浆样本，加入维拉帕米储备溶液，混匀；加入乙腈，混匀；离心，取上清液；加入甲酸水溶液，混匀，得到待测样品溶液(E)液相色谱分离：将待测样品溶液进行液相色谱分离；(F)进行质谱分析：将液相色谱分离后的样品进行质谱检测。本发明专利技术的血浆中阿西莫林浓度的检测方法操作简单、分析快速、特异性高、分离度高。

Determination of amoxicillin in plasma by HPLC-MS / MS

【技术实现步骤摘要】
血浆阿莫西林浓度的HPLC-MS/MS检测方法
本专利技术涉及抗生素类药物的血药浓度监测
，特别是涉及血浆阿莫西林浓度的HPLC-MS/MS检测方法。
技术介绍
阿莫西林(Amoxicillin)，青霉素类、β-内酰胺类抗生素，杀菌作用强，穿透细胞壁的能力也强，是目前应用较为广泛的口服青霉素之一。临床应用阿莫西林的不良反应发生率约为5～6％，因反应而停药者约2％，具有安全范围小、体内代谢个体差异大、毒性较强等特点，且其疗效和不良反应与血浆中药物浓度密切相关，需要根据血药浓度调整给药方案，故有必要对其进行临床血药浓度监测。药典中规定的阿莫西林含量测定方法为高效液相色谱法，具体实验方法如下：取装量差异项下的内容物，混合均匀，精密量取(约相当于阿莫西林0.125g)，加流动相溶解并稀释成每1mL中约含0.5mg的溶液，滤过，取续滤液，精密量取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图；另取阿莫西林对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算出供试品中C16H19N3O5S的含量。色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(用2mol/L氢氧化钾溶液调节pH值至5.0)-乙腈(97.5∶2.5)为流动相；流速为每分钟约1mL；检测波长为254nm。理论板数按阿莫西林计算不低于2000。上述药典中规定分析方法涉及大量的化学预处理步骤，操作相对繁琐，特别是磷酸缓冲液的配制和标定，耗时较长，给实际工作带来许多不便。目前，阿莫西林血药浓度测定的常见方法有：高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用法。由于阿莫西林极性较大且热稳定性差，不能通过液液萃取后挥干复溶来纯化浓集，早期检测采用繁琐的超滤方法处理，后期研究中的样本前处理则往往采用2-3倍量的甲醇或乙腈或高氯酸用以沉淀蛋白。但沉淀蛋白无法完全纯化样本，而且采用LC-MS检测时的基质效应会产生干扰；加入沉淀剂离心后取上清液进行检测往往会因为稀释倍数过大而灵敏度不够，为保证定量灵敏度，导致进样体积需要20μL以上，上清液与流动相的不匹配造成的溶剂效应往往会对色谱峰形产生较大干扰，需要在上样时加入一定比例的特定溶剂来消除溶剂效应。这些问题使得阿莫西林的检测仍然存在问题，导致在LC-MS普及的今天仍然有研究者采用HPLC来进行检测。阿莫西林微溶于水，在乙醇中几乎不溶。游离态分子式与分子量为C16H19N3O5S/365.40g/mol，水合物分子式与分子量为C16H19N3O5S·3H2O/419.45g/mol，具体结构如式(I)所示。其结构特点有：稠环张力导致该类化合物不稳定，内酰胺环易开环分解。本专利技术方法所选用内标为维拉帕米(Verapamil)，为罂粟碱类衍生物，常用其盐酸盐；可溶于水，在甲醇、乙醇或氯仿中易溶。游离态分子式与分子量为C27H38N2O4/454.60g/mol，盐酸盐分子式与分子量为C27H38N2O4·HCl/491.07g/mol，具体结构如式(II)所示。
技术实现思路
基于此，本专利技术提供一种血浆阿莫西林浓度的HPLC-MS/MS检测方法。该方法准确、快速、特异性强，具有较高的分离度。一种血浆阿莫西林浓度的HPLC-MS/MS检测方法，包括以下步骤：(A)储备液的制备：A1：取阿莫西林溶解于(50±5)％乙腈中，制得阿莫西林储备溶液；A2：取维拉帕米溶解于乙腈中，制得维拉帕米储备溶液；(B)工作溶液的制备：B1：用(50±5)％乙腈稀释阿莫西林储备溶液，制得混合标准曲线样本工作溶液和混合质控样本工作溶液；B2：用(50±5)％乙腈稀释维拉帕米储备溶液，制得混合标准曲线样本工作溶液和混合质控样本工作溶液；(C)标准曲线样本和质控样本的制备：向空白血浆中加入混合标准曲线工作溶液混合均匀，制备阿莫西林标准曲线样本和阿莫西林质控样本；(D)样本前处理：取血浆样本，加入维拉帕米储备溶液，混匀；加入乙腈，混匀；离心，取上清液；加入甲酸水溶液，混匀，得到待测样品溶液；(E)液相色谱分离：将待测样品溶液进行液相色谱分离；(F)进行质谱分析：将液相色谱分离后的样品进行质谱检测。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术取待测血浆样本加入内标工作液，再用乙腈沉淀蛋白后，离心后取上清，再加入稀释液，之后只需要极少的进样量进行分析就可以满足定量要求，样本预处理过程被大大简化。色谱检测过程中避免了溶剂效应的影响，色谱峰形极佳。本专利技术的血浆中阿西莫林浓度的检测方法操作简单、分析快速、特异性高、分离度高。附图说明图1为阿莫西林标准品和维拉帕米标准品的检测结果图。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将参照实施例对本专利技术进行更全面的描述，以下给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本专利技术提供一种血浆阿莫西林浓度的HPLC-MS/MS检测方法，包括以下步骤：(A)储备液的制备：A1：取阿莫西林溶解于(50±5)％乙腈中，制得阿莫西林储备溶液；A2：取维拉帕米溶解于乙腈中，制得维拉帕米储备溶液；(B)工作溶液的制备：B1：用(50±5)％乙腈稀释阿莫西林储备溶液，制得混合标准曲线样本工作溶液和混合质控样本工作溶液；B2：用(50±5)％乙腈稀释维拉帕米储备溶液，制得混合标准曲线样本工作溶液和混合质控样本工作溶液；(C)标准曲线样本和质控样本的制备：向空白血浆中加入混合标准曲线工作溶液混合均匀，制备阿莫西林标准曲线样本和阿莫西林质控样本；(D)样本前处理：取血浆样本，加入维拉帕米储备溶液，混匀；加入乙腈，混匀；离心，取上清液；加入甲酸水溶液，混匀，得到待测样品溶液；(E)液相色谱分离：将待测样品溶液进行液相色谱分离；(F)进行质谱分析：将液相色谱分离后的样品进行质谱检测。在其中一个实施例中，步骤(D)中，所述乙腈与血浆样本的体积比为：2-5:1，优选比为4-5:1；所述甲酸水溶液的浓度为(0.1±0.02)％。在样品预处理过程中，沉淀剂的量远大于血浆量，进样溶液体系与初始流动相比例接近，且进样量十分低，完全可以忽略溶剂效应的影响，使得分离效果极佳。在其中一个实施例中，步骤(D)中，所述离心的温度为2-8℃，所述离心的转速为2500-3500rpm，所述离心时间为5min-15min。在其中一个实施例中，步骤(E)中，所述液相色谱分离条件为：流动相：流本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种血浆阿莫西林浓度的HPLC-MS/MS检测方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(A)储备液的制备：/nA1：取阿莫西林溶解于(50±5)％乙腈中，制得阿莫西林储备溶液；/nA2：取维拉帕米溶解于乙腈中，制得维拉帕米储备溶液；/n(B)工作溶液的制备：/nB1：用(50±5)％乙腈稀释阿莫西林储备溶液，制得混合标准曲线样本工作溶液和混合质控样本工作溶液；/nB2：用(50±5)％乙腈稀释维拉帕米储备溶液，制得混合标准曲线样本工作溶液和混合质控样本工作溶液；/n(C)标准曲线样本和质控样本的制备：/n向空白血浆中加入混合标准曲线工作溶液混合均匀，制备阿莫西林标准曲线样本和阿莫西林质控样本；/n(D)样本前处理：取血浆样本，加入维拉帕米储备溶液，混匀；加入乙腈，混匀；离心，取上清液；加入甲酸水溶液，混匀，得到待测样品溶液；/n(E)液相色谱分离：将待测样品溶液进行液相色谱分离；/n(F)进行质谱分析：将液相色谱分离后的样品进行质谱检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种血浆阿莫西林浓度的HPLC-MS/MS检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(A)储备液的制备：
A1：取阿莫西林溶解于(50±5)％乙腈中，制得阿莫西林储备溶液；
A2：取维拉帕米溶解于乙腈中，制得维拉帕米储备溶液；
(B)工作溶液的制备：
B1：用(50±5)％乙腈稀释阿莫西林储备溶液，制得混合标准曲线样本工作溶液和混合质控样本工作溶液；
B2：用(50±5)％乙腈稀释维拉帕米储备溶液，制得混合标准曲线样本工作溶液和混合质控样本工作溶液；
(C)标准曲线样本和质控样本的制备：
向空白血浆中加入混合标准曲线工作溶液混合均匀，制备阿莫西林标准曲线样本和阿莫西林质控样本；
(D)样本前处理：取血浆样本，加入维拉帕米储备溶液，混匀；加入乙腈，混匀；离心，取上清液；加入甲酸水溶液，混匀，得到待测样品溶液；
(E)液相色谱分离：将待测样品溶液进行液相色谱分离；
(F)进行质谱分析：将液相色谱分离后的样品进行质谱检测。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(D)中，所述乙腈与血浆样本的体积比为：4-5:1；所述甲酸水溶液的浓度为(0.1±0.02)％。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(D)中，所述离心的温度为2-8℃；所述离心的转速为2500-3500rpm；所述离心的时间为5min-15min。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(E)中，所述液相色谱分离条件为：
流动相：流动相A为(0.1±0.02)％甲酸水溶液；流动相B为乙腈；采用梯度洗脱；
所述梯度洗脱过程为：0～1.3分钟，(50±5)％流动相A-流动相B；1.3～1.5分钟，(50±5)％流动相A-流动相B；1.5～2.3分钟，(5±2)％流动相A-流动相B；2.3～2.4分钟，(5±2)％流动相A-％流动相B；2.4～3分钟，(50±5)％流动相A-流动相B；
流速为0.4mL/min-0.8mL/min；进样体积为2μL.00-4.00μL；柱温设置为25-35℃；自动进样器温度为2-6℃；洗针液：(50±5)％乙腈片；洗冲速度：30-40μL/sec；洗针液体积：400-600μL。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(E)中，所述流动相A为0.1％甲酸水溶液；所述梯度洗脱过程为：0～1.3分钟，50％流动相A-流动相B；1.3～1.5分钟，50％流动相A-流动相B；1.5～2.3分钟，5％流动相A-流动相B；2.3～2.4分钟，5％流动相A-％流动相B；2.4～3分钟，50％流动相A-流动相B；
流速0.6mL/min；进样体积为3.00μL；柱...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晶晶，殷玮，周兰华，胡钟芳，吴宜，陈新阳，
申请(专利权)人：广州医药研究总院有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44