用于检测阿尔兹海默病生物标记物的检测试剂、试剂盒、制备方法和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测阿尔兹海默病生物标记物的检测试剂、试剂盒、制备方法和检测方法，涉及生物标志物检测技术领域。本发明专利技术公开的检测试剂，其包括第一检测试剂和第二检测试剂中的至少一种。采用本发明专利技术提供的检测试剂、试剂盒或方法检测阿尔兹海默病的生物标记物，能够简便、准确、高效地对生物标志物定量检测，能够满足对灵敏性和特异性等方面的要求，对于阿尔兹海默病的早期诊断具有重要的意义。

Detection reagents, kits, preparation methods and detection methods for the detection of biomarkers of Alzheimer's disease

【技术实现步骤摘要】
用于检测阿尔兹海默病生物标记物的检测试剂、试剂盒、制备方法和检测方法
本专利技术涉及生物标志物检测
，具体而言，涉及一种用于检测阿尔兹海默病生物标记物的检测试剂、试剂盒、制备方法和检测方法。
技术介绍
阿尔兹海默病(Alzheimer'sdisease,AD)是一种严重的大脑神经退行性疾病，多发于老年人，疾病进展会导致严重的认知功能损害和记忆障碍。由于目前还没有治愈的方法，因此AD的早期诊断至关重要。有研究表明，血清中的Aβ蛋白和tau蛋白可以作为AD临床实验室诊断的可能标志物。目前临床主要依赖ELISA法检测AD患者脑脊液中两种蛋白水平，此方法通常受到交叉反应和高非特异性结合的影响，灵敏性低，检测限只可达0.312ng/mL和0.15ng/mL，并且脑脊液的采集对患者创伤大。因此，急需一种超灵敏的分析方法来选择性测量血液样本中的Aβ蛋白和tau蛋白水平。拉曼光谱技术能够反映物质分子的结构信息，不同生物分子呈现出其特异的光谱峰位和强度特征，可用作生物分子的“指纹鉴定”。表面增强拉曼散射光谱技术(SERS)能利用贵金属纳米材料的表面等离子体共振效应，使吸附在金属粗糙表面的生物分子的拉曼信号强度增大103～106倍，具有较高的灵敏度和特异度，从而使其成为一种检测痕量生物分子的重要工具,并应用于肿瘤标志物的鉴定。但是现有的使用表面增强拉曼散射光谱技术检测阿尔兹海默病生物标志物Aβ蛋白和tau蛋白的相关试剂盒等拉曼增强效果不理想，并且对目标分子的检测灵敏度低。鉴于此，特提出本专利技术。<br>
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测阿尔兹海默病生物标记物的检测试剂、试剂盒、制备方法和检测方法。采用本专利技术提供的检测试剂、试剂盒或方法检测阿尔兹海默病的生物标记物，能够简便、准确、高效地对生物标志物定量检测，能够满足对灵敏性和特异性等方面的要求，对于阿尔兹海默病的早期诊断具有重要的意义。本专利技术是这样实现的：第一方面，本专利技术实施例提供一种用于检测阿尔兹海默病生物标记物的检测试剂，其包括第一检测试剂和第二检测试剂中的至少一种；所述第一检测试剂包括同时负载有第一抗体和拉曼信号分子的纳米金属颗粒；所述第二检测试剂包括负载有第二抗体的SERS基底，所述SERS基底为磁性氧化石墨烯；其中，所述第一抗体和所述第二抗体均能够特异性结合所述阿尔兹海默病的生物标记物。本专利技术实施例提供的检测试剂包括第一检测试剂和第二检测试剂，其中第二检测试剂以磁性氧化石墨烯作为基底并负载能够特异性结合所述生物标记物的第二抗体，第一检测试剂包括负载有第一抗体和拉曼信号分子的纳米金属颗粒，本专利技术的专利技术人通过利用磁性氧化石墨烯作为基底和利用纳米金属颗粒增强拉曼散射的特性，以及利用双抗夹心法的检测原理设计出上述的用于检测阿尔兹海默病生物标记物的检测试剂，并通过实验验证惊喜了发现，使用本专利技术的检测试剂检测时，提高了检测的灵敏度和拉曼散射的效果，克服了现有检测试剂灵敏低和拉曼散射效果不理想的问题。本专利技术提供的检测试剂同时也为阿尔兹海默病的早期诊断提供了新的选择和思路。本专利技术的第一检测试剂和第二检测试剂进行检测的原理或方法是：先使用待测样本与第二检测试剂混合，如果待测样本含有生物标记物，则被结合到SERS基底上，再将第一检测试剂与第二检测试剂混合，由于SERS基底上结合的生物标记物，负载有第一抗体和拉曼信号分子的纳米金属颗粒通过第一抗体与生物标记物的结合而被结合至基底上，这样通过拉曼光谱仪检测拉曼信号分子的强度，即可反应样本中的生物标记物的有无以及浓度。在可选的实施方式中，所述检测试剂包括第一检测试剂和第二检测试剂。在可选的实施方式中，所述纳米金属颗粒选自金、银、铂、钯或其组合。在可选的实施方式中，所述纳米金属颗粒为银。在可选的实施方式中，所述纳米金属颗粒的直径为8-11nm。本专利技术对纳米金属颗粒的金属类别不作特别限定，只要是金、银、铂、钯或者是这些金属中任意两种以上的合金等也是可以的，无论选用何种纳米金属，其均属于本专利技术的保护范围。在可选的实施方式中，所述拉曼信号分子选自4-巯基苯甲酸(4-MBA)、对巯基苯甲酸、对巯基苯胺、对巯基苯硼酸、2-硝基-5-巯基苯甲酸、2-氨基-6-巯基嘌呤、4-巯基吡啶、对巯基苯胺和罗丹明6G中的任意一种。本专利技术对拉曼信号分子的类别不作特别限定，只要是4-巯基苯甲酸(4-MBA)、对巯基苯甲酸、对巯基苯胺、对巯基苯硼酸、2-硝基-5-巯基苯甲酸、2-氨基-6-巯基嘌呤、4-巯基吡啶、对巯基苯胺或罗丹明6G等能够有产生拉曼信号的物质均可以应用至本专利技术，无论选择何种拉曼信号分子，其均是属于本专利技术的保护范围。在可选的实施方式中，所述生物标记物为Aβ蛋白或tau蛋白。目前，Aβ蛋白或tau蛋白是阿尔兹海默病的主要标志物，但这不意味着本专利技术的生物标记物仅限于Aβ蛋白或tau蛋白，只要是可以作为诊断阿尔兹海默病的任何标志物，其均可以是本专利技术检测试剂的检测对象，因此，无论选择何种生物标志物作为检测对象，其均属于本专利技术的保护范围。另外，本领域技术人员可以根据需要，选择合适的抗生物标记物的抗体负载至纳米金属颗粒和磁性氧化石墨烯上，这对本领域技术人员来说是不需要付出创造性劳动的，因此，无论选择何种抗体，其主要是能够特异性结合生物标志物，即属于本专利技术的保护范围。第二方面，实施例提供一种检测阿尔兹海默病生物标记物的试剂盒，其包括前述实施方式所述的检测试剂。第三方面，实施例提供如前述实施方式任一项所述的检测试剂的制备方法，其包括如下步骤(a)和/或(b)：步骤(a)：在所述纳米金属颗粒表面负载所述第一抗体和所述拉曼信号分子；步骤(b)：在所述SERS基底表面负载所述第二抗体，所述SERS基底为磁性氧化石墨烯。本专利技术实施例提供的制备方法操作简单，所制备的检测试剂具有灵敏度高，拉曼散射效果理想的特点。在可选的实施方式中，所述步骤(a)包括：步骤(a1)：将所述拉曼信号分子负载于所述纳米金属颗粒表面；步骤(a2)：将所述第一抗体负载于结合有所述拉曼信号分子的纳米金属颗粒表面。在可选的实施方式中，所述步骤(a1)包括：将含有所述纳米金属颗粒的分散液A与含有所述拉曼信号分子的溶液混合，得到混合溶液。在可选的实施方式中，所述步骤(a1)还包括：搅拌所述混合溶液进行搅拌，搅拌时间为6-8h。在可选的实施方式中，在搅拌结束后，对所述混合溶液进行固液分离，获取固体分离物，将所述固体分离物分散于水中，得到含有负载有所述拉曼信号分子的纳米金属颗粒的分散液B。在可选的实施方式中，采用离心方式对所述混合溶液进行固液分离。在可选的实施方式中，离心的转速为13000-15000rpm，4-6min。在可选的实施方式中，所述步骤(a2)包括：往所述分散液B中加入活化剂，搅拌，离心后取沉淀，用PBS进行分散，得到分散液C，将所述分散液C与本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测阿尔兹海默病生物标记物的检测试剂，其特征在于，其包括第一检测试剂和第二检测试剂中的至少一种；/n所述第一检测试剂包括同时负载有第一抗体和拉曼信号分子的纳米金属颗粒；/n所述第二检测试剂包括负载有第二抗体的SERS基底，所述SERS基底为磁性氧化石墨烯；/n其中，所述第一抗体和所述第二抗体均能够特异性结合所述阿尔兹海默病的生物标记物。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测阿尔兹海默病生物标记物的检测试剂，其特征在于，其包括第一检测试剂和第二检测试剂中的至少一种；
所述第一检测试剂包括同时负载有第一抗体和拉曼信号分子的纳米金属颗粒；
所述第二检测试剂包括负载有第二抗体的SERS基底，所述SERS基底为磁性氧化石墨烯；
其中，所述第一抗体和所述第二抗体均能够特异性结合所述阿尔兹海默病的生物标记物。


2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括第一检测试剂和第二检测试剂；
优选地，所述纳米金属颗粒选自金、银、铂、钯或其组合；
优选地，所述纳米金属颗粒为银；
优选地，所述纳米金属颗粒的直径为8-11nm。


3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述拉曼信号分子选自4-巯基苯甲酸、对巯基苯甲酸、对巯基苯胺、对巯基苯硼酸、2-硝基-5-巯基苯甲酸、2-氨基-6-巯基嘌呤、4-巯基吡啶、对巯基苯胺和罗丹明6G中的任意一种；
优选地，所述拉曼信号分子为4-巯基苯甲酸。


4.根据权利要求1-3任一项所述的检测试剂，其特征在于，所述生物标记物为Aβ蛋白或tau蛋白。


5.一种检测阿尔兹海默病生物标记物的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的检测试剂。


6.如权利要求1-4任一项所述的检测试剂的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤(a)和/或(b)：
步骤(a)：在所述纳米金属颗粒表面负载所述第一抗体和所述拉曼信号分子；
步骤(b)：在所述SERS基底表面负载所述第二抗体，所述SERS基底为磁性氧化石墨烯。


7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)包括：
步骤(a1)：将所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：李世宝，黄庆利，马萍，蓝婷，于丹，张好良，孙静芳，郑培明，
申请(专利权)人：徐州医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32