本发明专利技术公开了一种隐孢子虫蛋白激酶660C端蛋白的制备及其应用，包括如下步骤：S1.以SEQ ID NO：1～2所示扩增引物PCR扩增反应得到Cp660C基因片段；S2.将Cp660C基因片段与原核表达质粒双酶切，连接，得到Cp660C重组质粒；S3.将Cp660C重组质粒转入表达宿主菌，挑取阳性克隆菌；S4.将阳性克隆菌扩大培养至生长对数期，诱导表达；S5.诱导表达后的菌液，冷冻离心收集菌体，弃上清，清洗菌体后重悬，添加蛋白酶抑制剂，冰浴超声裂解菌体，得裂解液，再低温离心取上清，滤膜过滤；S6.取步骤过滤后上清液经Ni柱纯化，洗脱，收集目的蛋白。本发明专利技术方法能够得到高纯度、高抗原特异性的重组蛋白，所纯化得到的蛋白能够进一步用于隐孢子虫蛋白功能性分析研究。
Preparation and application of C-terminal protein of Cryptosporidium protein kinase 660
【技术实现步骤摘要】
一种隐孢子虫蛋白激酶660C端蛋白的制备及其应用
本专利技术涉及生物
，更具体地，涉及一种隐孢子虫蛋白激酶660C端蛋白的体外重组蛋白的制备及其应用。
技术介绍
隐孢子虫是一种人兽共患寄生原虫，在全世界流行，它的宿主范围广泛，包括野生动物、伴侣动物或者经济动物，甚至人类均可感染隐孢子虫。隐孢子虫病主要引起轻到重度腹泻和呕吐，尤其是在幼龄个体中引起厌食、水样腹泻、腹痛、呕吐、疲劳以及低烧等症状。隐孢子虫病病程因宿主机体免疫力而定，免疫良好机体发生自限性腹泻和持续性的胃肠道疾病，成为带虫宿主；而对于免疫缺陷病人如艾滋病人或免疫系统不完善的个体如婴幼儿，则会引起严重的腹泻，甚至引起死亡。隐孢子虫可以感染几乎所有的脊椎动物。对于一岁以内的幼龄经济动物如牛、羊和猪，累计感染率接近100％，近年来，伴侣动物如猫、狗，野生动物如非人灵长类动物等的隐孢子虫感染率大幅提升。在70多个已知的虫种和基因型中，有超过20个能够对人类造成不同程度的感染。根据2015年世界卫生组织公布的数据，隐孢子虫病造成860万人患病，3759人死亡以及296156人残疾。在24种食源性寄生虫病原体中，隐孢子虫位列第五，在发展中国家儿童腹泻的病例中，隐孢子虫成为第二号病原。一方面是因为人们对于隐孢子虫的认识不够从而未能引起足够的重视，另一方面是现有的卫生条件不足以清除宿主范围广泛的隐孢子虫。由于大规模爆发疾病，大多数发达国家以及部分发展中国家如中国将隐孢子虫作为一种法定传染病病原加以控制，使得隐孢子虫成为了我国现有水质标准中仅有的两个病原之一。目前，由于人们对于隐孢子虫的入侵机制知之甚少，使得研发隐孢子虫病药物进程受阻。对于经济动物来说，卤夫酮乳酸盐(halofuginonelactate)是唯一注册的治疗家畜的有效药物，但这种药物的局限性在于，它需要连续给药7天，且只能治疗腹泻时间低于24小时的小牛。对于人类来说，硝唑尼特(Nitazoxanide)是美国FDA唯一批准用于治疗大于12个月的幼龄儿童的药物，但它对于HIV/AIDS病人来说没有治疗效果，即使是高剂量治疗。与大多数顶复门原虫相似，隐孢子虫为了适应消化道内的厌氧环境，一些真核生物共有的细胞器，如核糖体、线粒体和叶绿体等获取营养物质和能量转换的结构逐渐退化，进而进化出一些独特的分泌型细胞器，如微线体、棒状体和致密颗粒，它们在虫子整个生活史中占据了举足轻重的地位。其中，微线体与棒状体位于虫体顶端，致密颗粒分布于虫体全身，就功能而言，微线体分泌的蛋白主要与宿主细胞的粘附有关，棒状体分泌蛋白与纳虫空泡形成过程有关，而致密颗粒分泌的蛋白则与入侵宿主细胞过程有关。隐孢子虫全基因组测序的完成以及对基因功能的注释为我们研究隐孢子虫致病机理提供了新方向。我们发现，蛋白酶(protease)是隐孢子虫的蛋白家族中数量最多的成员，它在顶复门原虫的入侵和发育中起到了至关重要的作用，顶复门原虫具有保守的入侵机制，而隐孢子虫的入侵机制则更为保守。入侵期间，虫体细胞器蛋白的分泌、修饰、活化以及作用与宿主细胞膜均以蛋白酶密切相关。而在这其中，有一种虫种间以及虫种内均有高度多态性的蛋白酶，其主要功能结构域集中在蛋白C端，这不仅是潜在的种间遗传进化的标志，也是调控种内不同毒力的潜在蛋白。例如微小隐孢子虫蛋白酶660，研究表明，660C端蛋白在不同虫种间的氨基酸序列相似度不到90％，且在同一虫种不同亚型之间存在着氨基酸的缺失与增添。因为没有纯化得到此类蛋白，因此对此功能尚未能够得到有效验证。由于此类蛋白酶分子量过大，且其功能尚未确定，体外表达过程中常出现微量表达甚至无法表达或表达过程中出现自切降解等问题，影响后续蛋白功能及酶学的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种隐孢子虫蛋白激酶660C端蛋白的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供所述制备方法在蛋白激酶660功能验证中的应用。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：一种隐孢子虫蛋白激酶660C端蛋白的制备方法，包括如下步骤：S1.以隐孢子虫基因组DNA为模板，SEQIDNO：1～2所示序列为扩增引物，PCR扩增得到Cp660C基因片段；S2.将S1所述将扩增得到的Cp660C基因片段与原核表达质粒双酶切，连接，得到Cp660C重组质粒；S3.将S2的Cp660C重组质粒转入表达宿主菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL，挑取阳性克隆菌，保存；S4.将S3挑取的阳性克隆菌扩大培养，当菌体生长至OD600为0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，诱导条件16℃，180rpm，诱导12h；S5.取S4诱导表达后的菌液，冷冻离心收集菌体，弃上清，清洗菌体后重悬，以1:100比例添加蛋白酶抑制剂，冰浴超声裂解菌体，得裂解液，再低温离心取上清，并用0.45μm的滤膜进行过滤；S6.取步骤S5中过滤后上清液经Ni柱纯化，洗脱，收集目的蛋白。本专利技术利用SEQIDNO：1～2所示序列为扩增引物，通过PCR扩增反应得到片段长度大小为1107bp的Cp660C基因片段；通过创造性的选择上述功能结构域片段进行表达的方式，提高了表达蛋白的产量的同时又不影响后续的功能验证；同时，本专利技术通过特定宿主菌的转导、低温诱导以及改良IPTG浓度和诱导时间的方式，提高了表达蛋白的可溶性；并在裂解菌体过程中添加一定比例蛋白酶抑制剂的方式，保护了表达蛋白的完整性；从而成功在体外纯化得到具有高纯度、高抗原特异性的蛋白激酶660C端重组蛋白，即可用于蛋白的功能验证，无需获得完整的蛋白激酶660序列。优选地，步骤S1所述PCR扩增反应体系为：Phusion酶0.5μL，上游引物2.5μL，下游引物2.5μL，DNA模板1μL，2mMdNTPs5μL，5xPhusionHFbuffer10μL，ddH2O28.5μL，一共50μL。优选地，步骤S1所述PCR扩增反应程序为：98℃预变性5min；98℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸35s，35个循环；最后72℃延伸7min。优选地，步骤S2所述原核表达质粒为pET-28a质粒。优选地，步骤S5具体为4℃离心收集菌体，8000rpm离心10min，弃上清；用25mLPBS清洗菌体，反复清洗3～5次；每100mL菌液加10mlPBS重悬菌体，以1:50～1:200比例添加蛋白酶抑制剂；超声裂解菌体，工作效率为45％，工作时长2s，暂停时长4s，共时长40～60min，过程在冰浴中进行；裂解后的菌液4℃离心，8000rpm，10min，收集上清，并用0.45μm的滤膜进行过滤。更优选地，所述蛋白酶抑制剂的添加比例为1:100。优选地，步骤S6所述Ni柱在加入蛋白样品前先加入5倍柱体积无离子水将填料中的20％乙醇洗涤干净；再用5倍柱体积pH＝8.0结合缓冲液平衡Ni柱。优选地，所述洗脱为将蛋白样品加入Ni柱中，使之与树脂混合均匀，冰上孵本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种隐孢子虫蛋白激酶660C端蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1.以隐孢子虫基因组DNA为模板，SEQ ID NO：1～2所示序列为扩增引物，PCR扩增反应得到Cp660C基因片段；/nS2.将S1所述将扩增得到的Cp660C基因片段与原核表达质粒双酶切，连接，得到Cp660C重组质粒；/nS3.将S2的Cp660C重组质粒转入表达宿主菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL，挑取阳性克隆菌，保存；/nS4.将S3挑取的阳性克隆菌扩大培养，当菌体生长至OD
【技术特征摘要】
1.一种隐孢子虫蛋白激酶660C端蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.以隐孢子虫基因组DNA为模板，SEQIDNO：1～2所示序列为扩增引物，PCR扩增反应得到Cp660C基因片段；
S2.将S1所述将扩增得到的Cp660C基因片段与原核表达质粒双酶切，连接，得到Cp660C重组质粒；
S3.将S2的Cp660C重组质粒转入表达宿主菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL，挑取阳性克隆菌，保存；
S4.将S3挑取的阳性克隆菌扩大培养，当菌体生长至OD600为0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，16℃，180rpm，诱导12h；
S5.取S4诱导表达后的菌液，冷冻离心收集菌体，弃上清，清洗菌体后重悬，以1:50～1:200比例添加蛋白酶抑制剂，冰浴超声裂解菌体，得裂解液，再低温离心取上清，并用0.45μm的滤膜进行过滤；
S6.取步骤S5中过滤后上清液经Ni柱纯化，洗脱，收集目的蛋白。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述PCR扩增反应体系为：Phusion酶0.5μL，上游引物2.5μL，下游引物2.5μL，DNA模板1μL，2mMdNTPs5μL，5xPhusionHFbuffer10μL，ddH2O28.5μL，一共50μL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述PCR扩增反应程序为：98℃预变性5min；98℃变性45s，58℃退火...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯耀宇，张晨远，李娜，肖立华，郭亚琼，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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