一种梨PMEI蛋白体外表达的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种梨PMEI蛋白的体外表达纯化方法及其应用。通过设计引物克隆梨PMEI基因；构建大肠杆菌重组表达质粒PMEI‑pCold‑TF；将构建的重组表达质粒PMEI‑pCold‑TF转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)中，构建梨PMEI蛋白重组表达菌株；对重组菌株进行蛋白诱导表达，并用镍柱亲和层析法纯化重组梨PMEI蛋白；之后，用获得的重组梨PMEI蛋白处理梨花粉管及拟南芥根部。通过本发明专利技术的方法，实现了梨PMEI蛋白的首次体外表达及纯化，表达效率高，纯化蛋白稳定存在且纯度完全可以满足相关实验的需要；通过重组梨PMEI蛋白对梨花粉管和拟南芥根部的处理，促进了梨花粉管和拟南芥根部的生长。

A method of PmeI expression in vitro and its application

【技术实现步骤摘要】
一种梨PMEI蛋白体外表达的方法及其应用
本专利技术属于生物工程
，涉及一种梨PMEI蛋白体外表达的方法及其应用，具体涉及从梨花粉中克隆并纯化了一种梨PMEI蛋白，分别用该蛋白处理梨花粉管及拟南芥根部，促进了梨花粉管及拟南芥根部的生长。
技术介绍
果胶是双子叶植物和除禾本科外的单子叶植物初生细胞壁的主要组成成分，也是花粉壁和花粉管壁的主要组成成分。在植物生长发育的过程中，果胶的降解和修饰需要一系列酶的参与，其中，果胶甲酯酶(pectinmthylesterases,PMEs)是果胶降解和代谢过程中一类重要的水解酶，使得甲酯化的果胶去甲酯化，从而调节胞壁的硬度和弹性。果胶甲酯酶抑制子(pectinmthylesteraseinhibitors,PMEIs)是一种调控PME活性的蛋白质，能够与PME形成可逆的1:1非共价复合体，通过覆盖活性位点来抑制PME的活性。PMEI对PME的抑制作用调控了果胶的甲酯化程度，从而对细胞壁力学产生了影响。研究表明，PMEI在种子萌发、下胚轴伸长、花粉萌发和花粉管生长、果实成熟，以及应对各种生物及非生物胁迫中发挥了不可或缺的作用。分离纯化PMEI蛋白将促进对其生物学功能及作用机制的进一步研究。PMEI广泛存在于植物的各类组织和生长阶段中，但分离纯化天然的PMEI蛋白难度大，且化学合成PMEI的成本高。所以，利用基因工程技术制备重组PMEI蛋白是解决上述问题的一个有效途径。基因工程技术制备重组蛋白的方法获得了广泛的应用。至今为止，人们已构建了多种蛋白表达系统，如原核表达系统、真核表达系统、无细胞表达系统等。大肠杆菌表达系统是最常用的原核表达系统，具有遗传背景简单、生化特性明确、生长速度快、经济成本低、表达水平高、产物易于分离纯化及便于工厂化生产等优点。自构建以来，众多重组蛋白已经通过大肠杆菌表达系统制备出来。利用基因工程技术纯化出的PMEI蛋白去处理梨花粉管及拟南芥的根部，可以观测到其对于梨花粉管及拟南芥的根部生长的促进效用。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种低成本、高产率、易纯化的梨PMEI蛋白体外表达的制备方法。本专利技术另一目的是提供梨PMEI蛋白在促进梨花粉管及拟南芥根部生长中的应用。本专利技术的目的可以采用以下技术方案来实现：一种梨PMEI蛋白体外表达的方法，包括以下步骤：(1)提取梨花粉总RNA，反转录成cDNA，设计引物以反转录生成的cDNA为模板进行PCR扩增梨PMEI基因；(2)构建梨PMEI蛋白的大肠杆菌原核表达重组质粒；(3)将步骤(2)中构建的重组质粒用热激法转化到大肠杆菌菌株Rosetta(DE3)中，构建梨PMEI蛋白的原核表达重组菌株；(4)培养步骤(3)中构建的重组大肠杆菌菌株至OD600为0.4-0.6，低温处理后加入IPTG诱导梨PMEI蛋白的表达；(5)纯化诱导表达的梨PMEI蛋白；(6)重组梨PMEI蛋白的鉴定。作为一种优选技术方案，步骤(1)中用于PCR扩增梨PMEI基因的正向引物为：5’-ATGGAGCTCGGTACCCTCGAGAGAGCGTCTCAATTAGTTAGGAGTGTTTG-3’，反向引物为：5’-AGCAGAGATTACCTATCTAGACTAGATATTTAATAACTGGGAAGTAAC-3’。进一步优选的，步骤(1)中，PCR扩增梨PMEI基因的反应体系为：ddH2O19μl，上下游引物各2.5μl,cDNA1μl,2×SuperPfxMasterMix25μl；PCR反应条件为：98℃预变性3min，然后进行98℃10s，60℃30s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。进一步优选的，步骤(2)中，构建梨PMEI蛋白的原核表达重组质粒中所使用的大肠杆菌原核表达载体为pCold-TF，梨PMEI基因插入的酶切位点为XhoI和XbaI位点。作为一种详细技术方案，步骤(2)中，PCR扩增梨PMEI基因的产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收，回收产物用同源重组酶连接到经XhoI和XbaI限制性内切酶双酶切后的大肠杆菌原核表达载体pCold-TF上。进一步优选的，步骤(4)中，所述的低温处理为于冰上静置5min，再于15℃静置40分钟，所述诱导剂IPTG的终浓度为0.5mmol/L，所述诱导表达的条件为15℃，时间为24小时。诱导梨PMEI蛋白表达的详细过程为：将梨PMEI蛋白的大肠杆菌原核表达重组载体按照1:50的比例接种到100mlLB液体培养基中，于37℃、220rpm震荡培养过夜，再按1:50的比例转接到300mlLB液体培养基中，于37℃、220rpm震荡培养至菌液OD600为0.4-0.6，迅速于冰上静置5分钟，再于15℃静置40分钟；加入终浓度为0.5mmol/L的诱导剂IPTG，15℃、220rpm震荡培养,诱导表达24小时；其中，所述LB液体培养基中含有100μg/ml氨苄青霉素。进一步优选的，步骤(5)中，纯化诱导表达的梨PMEI蛋白的详细过程为：诱导表达完成后，于4℃、10000rpm离心10分钟后弃上清，收集菌体沉淀，向沉淀中加入20ml裂解液重悬沉淀；重悬液使用超声破碎至澄清后，4℃、10000rpm离心10分钟，收集上清，上清经0.45μm滤膜过滤后，使用镍柱亲和层析法对梨PMEI蛋白进行纯化；纯化蛋白前，用10倍柱体积的平衡缓冲液来平衡镍柱亲和层析介质；收集纯化蛋白，用截流量为30kDa的超滤管于4℃、6000rpm下进行浓缩、脱盐，-80℃保存备用；其中，所述超声破碎法的超声功率为240w，条件为开启3s，停7s，共27分钟；所述裂解液的配方为：140mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，1.8mM磷酸二氢钾，50×EDTA-freeproteaseinhibitorcocktailIII，pH为7.3；所述平衡缓冲液的配方为：500mM氯化钠，20mM三(羟甲基)氨基甲烷，5mM咪唑，pH为7.3。所述梨PMEI蛋白N端带有6个组氨酸标签(His-Tag)。进一步优选的，步骤(6)中，重组梨PMEI蛋白的鉴定方法为SDS-PAGE电泳分析法。SDS-PAGE电泳分析法鉴定重组梨PMEI蛋白的具体过程为：取50μl纯化后样品，加入25μl2×SDS-PAGE上样缓冲液后，取10μl混合液进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后鉴定梨PMEI蛋白。梨PMEI蛋白在促进梨花粉管及拟南芥根部生长中的应用。上述的应用，用上述的方法表达的重组梨PMEI蛋白处理梨花粉管或拟南芥根部。测量并统计梨花粉管长度及拟南芥根部长度的变化，验证重组梨PMEI蛋白对梨花粉管及拟南芥根部生长的促进作用。为评定梨PMEI蛋白对梨花粉管及拟南芥根部生长的效用，取同时间段于未加梨PMEI蛋白的梨培养基中培养的梨花粉管和未涂布梨PMEI蛋白的MS培养基上生长的拟南芥为阴性对照，测量并统计花粉管及根部长度的变化。作为一种优选技术方案，用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种梨PMEI蛋白体外表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)提取梨花粉总RNA，反转录成cDNA，设计引物，以反转录生成的cDNA为模板进行PCR扩增梨PMEI基因；/n(2)构建梨PMEI蛋白的大肠杆菌原核表达重组质粒；/n(3)将步骤(2)中构建的重组质粒用热激法转化到大肠杆菌菌株Rosetta(DE3)中，构建梨PMEI蛋白的原核表达重组菌株；/n(4)培养步骤(3)中构建的重组大肠杆菌菌株至OD

【技术特征摘要】
1.一种梨PMEI蛋白体外表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取梨花粉总RNA，反转录成cDNA，设计引物，以反转录生成的cDNA为模板进行PCR扩增梨PMEI基因；
(2)构建梨PMEI蛋白的大肠杆菌原核表达重组质粒；
(3)将步骤(2)中构建的重组质粒用热激法转化到大肠杆菌菌株Rosetta(DE3)中，构建梨PMEI蛋白的原核表达重组菌株；
(4)培养步骤(3)中构建的重组大肠杆菌菌株至OD600为0.4-0.6，低温处理后加入IPTG诱导梨PMEI蛋白的表达；
(5)纯化诱导表达的梨PMEI蛋白；
(6)重组梨PMEI蛋白的鉴定。


2.根据权利要求1所述的梨PMEI蛋白体外表达的方法，其特征在于，步骤(1)中，用于PCR扩增梨PMEI基因的正向引物为：5’-
ATGGAGCTCGGTACCCTCGAGAGAGCGTCTCAATTAGTTAGGAGTGTTTG-3’，反向引物为：5’-AGCAGAGATTACCTATCTAGACTAGATATTTAATAACTGGGAAGTAAC-3’。


3.根据权利要求1或2所述的梨PMEI蛋白体外表达的方法，其特征在于，步骤(1)中，PCR扩增梨PMEI基因的反应体系为：ddH2O19μl，上下游引物各2.5μl,cDNA1μl,2×SuperPfxMasterMix25μl；PCR反应条件为：98℃预变性3min，然后进行98℃10s，60℃30s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。


4.根据权利要求1所述的梨PMEI蛋白体外表达的方法，其特征在于，步骤(2)中，构建梨PMEI蛋白的原核表达重组质粒中所使用的大肠杆菌原核表达载体为pCold-TF，梨PMEI基因插入的酶切位点为XhoI和XbaI位点。


5.根据权利要求1所述的梨PMEI蛋白体外表达的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的低温处理为于冰上静置5min，再于15℃静置40分钟，所述诱导剂IPTG的终浓度为0.5mmol/L，所述诱导表达的条件为15℃，时间为24小时。


6.根据权利要求1或5所述的梨PMEI蛋白体外表达的方法，其特征在于，步骤(4)中，诱导梨PMEI蛋白表达的详细过程为：...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴巨友，朱晓璇，汤超，王鹏，张绍铃，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32