用于生产白喉毒素多肽的系统和方法技术方案

描述了用于在经基因修饰的大肠杆菌(E.coli)中以高产率生产白喉毒素多肽或其突变形式(例如，类毒素CRM197多肽)的表达系统和方法。该系统和方法基于将生物质生长与重组蛋白诱导解偶联，即使用不能被所述细菌用作生长碳源的蛋白质生产诱导物。还描述了改善蛋白质产率的特定成分和条件的应用。

System and method for producing diphtheria toxin polypeptide

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生产白喉毒素多肽的系统和方法相关申请的交叉引用本申请要求于2017年8月17日提交的欧洲专利申请号17186713.8和于2018年8月14日提交的美国临时专利申请号62/718854的权益，其中每一篇申请通过引用整体并入本文。
本专利技术总体上涉及白喉毒素多肽(例如，天然白喉毒素多肽)或其变体(例如，用于结合疫苗CRM197的载体蛋白)的生产。
技术介绍
白喉毒素(DTx)是一种由白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)产毒菌株合成并分泌的535个氨基酸的单个多肽链的蛋白毒素，其含有由二硫键连接在一起的A(活性)结构域和B(结合)结构域。该毒素结合至细胞受体(HB-EGF受体)并通过内吞作用进入细胞，在此通过蛋白水解切割将所述A结构域从所述B结构域释放。然后，所述A结构域通过由所述B结构域形成的孔离开内体并进入细胞质，其在细胞质中抑制蛋白质合成，最终导致细胞死亡。白喉是由白喉棒状杆菌细菌引起的感染。症状和并发症(包括心肌炎和神经炎)是由所述细菌产生的DTx引起的。通过使用白喉类毒素(即通过甲醛(福尔马林)处理而获得的灭活形式的DTx结合佐剂(铝盐))进行接种来实现预防白喉。白喉疫苗以几种组合形式递送，一种包括破伤风类毒素(称为DT疫苗)，另一种包括破伤风和百日咳疫苗(称为DPT疫苗)。交叉反应物质197(CRM197)是Dtx的突变形式，其含有单个氨基酸取代(G52E)而使该蛋白质无酶促活性且无毒。已经发现CRM197是一种用于针对包膜细菌的结合疫苗的理想的载体。结合疫苗包含与免疫原性差和T细胞非依赖性荚膜多糖共价连接的CRM197，从而产生具有高度免疫原性的结合抗原，并导致针对所述抗原的长期免疫。含有CRM197作为载体蛋白的疫苗包括针对脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)的疫苗，例如针对B型流感嗜血杆菌(HaemophilusinfluenzaetypeB，Hib)的疫苗，例如和以及肺炎球菌疫苗，例如PrevnarTM。使用天然宿主菌株白喉棒状杆菌难以大量生产(>0.2克/升)白喉毒素多肽(例如，CRM197)。此外，经纯化的蛋白质不稳定，并且在冻融后会迅速降解。目前在天然种类白喉棒状杆菌的生产在发酵期间导致每升大约100-200mg的CRM197。已报道荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)菌株的产量大约为1.2-1.3g/L(PCT公开号WO2011/123139)。尽管CRM197的不溶性形式可以在大肠杆菌(E.coli)中发酵到相对中等的产量，但只有一小部分不溶性产物可以转化为可溶性形式(Stefan等人,JBiotechnol.2011年12月20日；156(4):245-52,2011)。另一个主要问题是商业化的蛋白质非常昂贵(每克经纯化的蛋白质高达100000美元)。因此，需要以更高产量生产可溶性、功能性和稳定的白喉毒素多肽(例如，DTx和CRM197)的系统和方法。本说明书涉及多个文件，其中每一个文件的内容通过引用整体并入本文，其程度与每个单独的出版物、专利或专利申请被明确和单独地指示通过引用整体并入的程度相同。如果发现本申请中的术语在通过引用并入本文的文件中被不同地定义，则以本文中提供的定义为准。
技术实现思路
本专利技术涉及用于生产白喉毒素多肽或其突变形式的系统、方法和产品。在各种方面和实施方案中，本公开内容提供了以下项目1至59：1.一种用于生产白喉毒素多肽或其突变形式的表达系统，所述表达系统包括：一种在鼠李糖分解代谢途径中有缺陷的大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞，所述大肠杆菌细胞包含异源核酸构建体，所述异源核酸构建体包含：(i)鼠李糖诱导型启动子序列；以及(ii)表达序列，所述表达序列包含第一部分和第二部分，所述第一部分包含编码与所述第二部分的5'末端连接的周质分泌信号的核苷酸序列，以及所述第二部分包含编码所述白喉毒素多肽或其突变形式的核苷酸序列，并且其中所述表达序列与所述鼠李糖诱导型启动子序列可操作地连接。2.项目1所述的表达系统，其中所述第二部分包含编码所述白喉毒素多肽的核苷酸序列。3.项目1所述的表达系统，其中所述第二部分包含编码所述白喉毒素多肽的突变形式的核苷酸序列。4.项目3所述的表达系统，其中所述白喉毒素多肽的突变形式为CRM197。5.项目1至4中任一项所述的表达系统，其中所述周质分泌信号包含氨基酸序列MKVKVLSLLVPALLVAGAANA(SEQIDNO：1)，或与作为周质分泌信号的SEQIDNO：1序列具有至少90％同一性的序列。6.项目1至5中任一项所述的表达系统，其中编码所述白喉毒素多肽或其突变形式的所述核苷酸序列是用于在大肠杆菌中表达的优化序列。7.项目6所述的表达系统，其中所述优化序列与编码所述白喉毒素多肽或其突变形式的天然核苷酸序列(例如，SEQIDNO：2的序列)具有至少95％的同一性。8.项目1至7中任一项所述的表达系统，其中所述大肠杆菌细胞是大肠杆菌B菌株细胞。9.项目9所述的表达系统，其中所述大肠杆菌B菌株细胞是大肠杆菌BL21菌株细胞。10.项目1至9中任一项所述的表达系统，其中所述鼠李糖诱导型启动子是rhaPBAD启动子。11.项目10所述的表达系统，其中所述rhaPBAD启动子包含核苷酸序列：CACCACAATTCAGCAAATTGTGAACATCATCACGTTCATCTTTCCCTGGTTGCCAATGGCCCATTTTCCTGTCAGTAACGAGAAGGTCGCGAATTCAGGCGCTTTTTAGACTGG(SEQIDNO：4)。12.项目1至11中任一项所述的表达系统，其中所述有缺陷的鼠李糖分解代谢途径是由编码参与所述鼠李糖分解代谢途径的多肽的基因的失活引起的。13.项目12所述的表达系统，其中参与所述鼠李糖分解代谢途径的所述多肽是L-鼠李树胶糖(rhamnulose)激酶(RhaB)。14.项目1至13中任一项所述的表达系统，其中所述大肠杆菌细胞包含有缺陷的鼠李糖转运蛋白(rhaT)基因。15.项目1至14中任一项所述的表达系统，其中所述大肠杆菌细胞包含有缺陷的麦芽糖转运蛋白亚基(malE)基因。16.项目1至15中任一项所述的表达系统，其中所述大肠杆菌细胞表达融合至亲和标签的亮氨酸/异亮氨酸/缬氨酸转运蛋白亚基(LivK)。17.项目16所述的表达系统，其中所述亲和标签为组氨酸标签。18.项目1至17中任一项所述的表达系统，其中所述大肠杆菌细胞包含有缺陷的sulA基因。19.一种生产白喉毒素多肽或其突变形式的方法，所述方法包括：(a)在含有除鼠李糖以外的碳源的培养基中培养项目1至18中任一项所述的大肠杆菌细胞，直至在600nm处的光密度(OD600)达到至少大约150；(b)向培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于生产白喉毒素多肽或其突变形式的表达系统，所述表达系统包括：/n一种在鼠李糖分解代谢途径中有缺陷的大肠杆菌(Escherichia coli)细胞，所述大肠杆菌细胞包含异源核酸构建体，所述异源核酸构建体包含：/n(i)鼠李糖诱导型启动子序列；以及/n(ii)表达序列，所述表达序列包含第一部分和第二部分，所述第一部分包含与所述第二部分的5'末端连接的编码周质分泌信号的核苷酸序列，以及所述第二部分包含编码所述白喉毒素多肽或其突变形式的核苷酸序列，并且其中所述表达序列与所述鼠李糖诱导型启动子序列可操作地连接。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170817 EP 17186713.8;20180814 US 62/718,8541.一种用于生产白喉毒素多肽或其突变形式的表达系统，所述表达系统包括：
一种在鼠李糖分解代谢途径中有缺陷的大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞，所述大肠杆菌细胞包含异源核酸构建体，所述异源核酸构建体包含：
(i)鼠李糖诱导型启动子序列；以及
(ii)表达序列，所述表达序列包含第一部分和第二部分，所述第一部分包含与所述第二部分的5'末端连接的编码周质分泌信号的核苷酸序列，以及所述第二部分包含编码所述白喉毒素多肽或其突变形式的核苷酸序列，并且其中所述表达序列与所述鼠李糖诱导型启动子序列可操作地连接。


2.根据权利要求1所述的表达系统，其中所述第二部分包含编码所述白喉毒素多肽的核苷酸序列。


3.根据权利要求1所述的表达系统，其中所述第二部分包含编码所述白喉毒素多肽的突变形式的核苷酸序列。


4.根据权利要求3所述的表达系统，其中所述白喉毒素多肽的突变形式为CRM197。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的表达系统，其中所述周质分泌信号包含氨基酸序列MKVKVLSLLVPALLVAGAANA(SEQIDNO：1)，或发挥周质分泌信号的功能、与SEQIDNO：1序列具有至少90％同一性的序列。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的表达系统，其中编码所述白喉毒素多肽或其突变形式的所述核苷酸序列是用于在大肠杆菌中表达的优化序列。


7.根据权利要求6所述的表达系统，其中所述优化序列与编码所述白喉毒素多肽或其突变形式的天然核苷酸序列(例如，SEQIDNO：2的序列)具有至少95％的同一性。


8.根据权利要求1至7中任一项所述的表达系统，其中所述大肠杆菌细胞是大肠杆菌B菌株细胞。


9.根据权利要求9所述的表达系统，其中所述大肠杆菌B菌株细胞是大肠杆菌BL21菌株细胞。


10.根据权利要求1至9中任一项所述的表达系统，其中所述鼠李糖诱导型启动子是rhaPBAD启动子。


11.根据权利要求10所述的表达系统，其中所述rhaPBAD启动子包含下述核苷酸序列：
CACCACAATTCAGCAAATTGTGAACATCATCACGTTCATCTTTCCCTGGTTGCCAATGGCCCATTTTCCTGTCAGTAACGAGAAGGTCGCGAATTCAGGCGCTTTTTAGACTGG(SEQIDNO：4)。


12.根据权利要求1至11中任一项所述的表达系统，其中所述有缺陷的鼠李糖分解代谢途径是由编码参与所述鼠李糖分解代谢途径的多肽的基因的失活引起的。


13.根据权利要求12所述的表达系统，其中参与所述鼠李糖分解代谢途径的所述多肽是L-鼠李树胶糖激酶(RhaB)。


14.根据权利要求1至13中任一项所述的表达系统，其中所述大肠杆菌细胞包含有缺陷的鼠李糖转运蛋白(rhaT)基因。


15.根据权利要求1至14中任一项所述的表达系统，其中所述大肠杆菌细胞包含有缺陷的麦芽糖转运蛋白亚基(malE)基因。


16.根据权利要求1至15中任一项所述的表达系统，其中所述大肠杆菌细胞表达融合至亲和标签的亮氨酸/异亮氨酸/缬氨酸转运蛋白亚基(LivK)。


17.根据权利要求16所述的表达系统，其中所述亲和标签为组氨酸标签。


18.根据权利要求1至17中任一项所述的表达系统，其中所述大肠杆菌细胞包含有缺陷的sulA基因。


19.一种生产白喉毒素多肽或其突变形式的方法，所述方法包括：
(a)在含有除鼠李糖以外的碳源的培养基中培养权利要求1至18中任一项所述的大肠杆菌细胞，直至在600nm处的光密度(OD600)达到至少大约150；
(b)向培养物中添加鼠李糖，并用含有碳源的溶液向所述培养物进料足以产生所述白喉毒素多肽或其突变形式的一段时间；以及
(c)收集从所述细胞的周质产生的白喉毒素多肽或其突变形式。


20.根据权利要求19所述的方法，其中进行所述培养步骤(a)直至OD600达到至少大约180或OD600达到大约180至大约220。


21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述培养基包含大约0.1g/L至大约100g/L，或大约5g/L至大约50g/L的酵母提取物。


22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中所述培养基包含浓度为至少大约0.001g/L的铁源。


23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其中所述培养步骤(a)的长度为大约24小时至大约32小时，或大约26小时至大约30小时，例如大约28小时。


24.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，其中所述培养步骤(a)包括第一阶段和第二阶段。


25.根据权利要求24所述的方法，其中在所述第一阶段，所述培养基中包含浓度为大约10g/L至大约30g/L或大约20g/L的...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·马森，M·阿保尔，MA·高里艾特，
申请(专利权)人：加拿大国家研究委员会，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA