用于生产白喉毒素多肽的系统和方法技术方案

描述了用于在经基因修饰的大肠杆菌(E.coli)中以高产率生产白喉毒素多肽或其突变形式(例如，类毒素CRM197多肽)的表达系统和方法。该系统和方法基于将生物质生长与重组蛋白诱导解偶联，即使用不能被所述细菌用作生长碳源的蛋白质生产诱导物。还描述了改善蛋白质产率的特定成分和条件的应用。

System and method for producing diphtheria toxin polypeptide

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生产白喉毒素多肽的系统和方法相关申请的交叉引用本申请要求于2017年8月17日提交的欧洲专利申请号17186713.8和于2018年8月14日提交的美国临时专利申请号62/718854的权益，其中每一篇申请通过引用整体并入本文。
本专利技术总体上涉及白喉毒素多肽(例如，天然白喉毒素多肽)或其变体(例如，用于结合疫苗CRM197的载体蛋白)的生产。
技术介绍
白喉毒素(DTx)是一种由白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)产毒菌株合成并分泌的535个氨基酸的单个多肽链的蛋白毒素，其含有由二硫键连接在一起的A(活性)结构域和B(结合)结构域。该毒素结合至细胞受体(HB-EGF受体)并通过内吞作用进入细胞，在此通过蛋白水解切割将所述A结构域从所述B结构域释放。然后，所述A结构域通过由所述B结构域形成的孔离开内体并进入细胞质，其在细胞质中抑制蛋白质合成，最终导致细胞死亡。白喉是由白喉棒状杆菌细菌引起的感染。症状和并发症(包括心肌炎和神经炎)是由所述细菌产生的DTx引起的。通过使用白喉类毒素(即通本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于生产白喉毒素多肽或其突变形式的表达系统，所述表达系统包括：/n一种在鼠李糖分解代谢途径中有缺陷的大肠杆菌(Escherichia coli)细胞，所述大肠杆菌细胞包含异源核酸构建体，所述异源核酸构建体包含：/n(i)鼠李糖诱导型启动子序列；以及/n(ii)表达序列，所述表达序列包含第一部分和第二部分，所述第一部分包含与所述第二部分的5'末端连接的编码周质分泌信号的核苷酸序列，以及所述第二部分包含编码所述白喉毒素多肽或其突变形式的核苷酸序列，并且其中所述表达序列与所述鼠李糖诱导型启动子序列可操作地连接。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170817 EP 17186713.8;20180814 US 62/718,8541.一种用于生产白喉毒素多肽或其突变形式的表达系统，所述表达系统包括：
一种在鼠李糖分解代谢途径中有缺陷的大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞，所述大肠杆菌细胞包含异源核酸构建体，所述异源核酸构建体包含：
(i)鼠李糖诱导型启动子序列；以及
(ii)表达序列，所述表达序列包含第一部分和第二部分，所述第一部分包含与所述第二部分的5'末端连接的编码周质分泌信号的核苷酸序列，以及所述第二部分包含编码所述白喉毒素多肽或其突变形式的核苷酸序列，并且其中所述表达序列与所述鼠李糖诱导型启动子序列可操作地连接。


2.根据权利要求1所述的表达系统，其中所述第二部分包含编码所述白喉毒素多肽的核苷酸序列。


3.根据权利要求1所述的表达系统，其中所述第二部分包含编码所述白喉毒素多肽的突变形式的核苷酸序列。


4.根据权利要求3所述的表达系统，其中所述白喉毒素多肽的突变形式为CRM197。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的表达系统，其中所述周质分泌信号包含氨基酸序列MKVKVLSLLVPALLVAGAANA(SEQIDNO：1)，或发挥周质分泌信号的功能、与SEQIDNO：1序列具有至少90％同一性的序列。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的表达系统，其中编码所述白喉毒素多肽或其突变形式的所述核苷酸序列是用于在大肠杆菌中表达的优化序列。


7.根据权利要求6所述的表达系统，其中所述优化序列与编码所述白喉毒素多肽或其突变形式的天然核苷酸序列(例如，SEQIDNO：2的序列)具有至少95％的同一性。


8.根据权利要求1至7中任一项所述的表达系统，其中所述大肠杆菌细胞是大肠杆菌B菌株细胞。


9.根据权利要求9所述的表达系统，其中所述大肠杆菌B菌株细胞是大肠杆菌BL21菌株细胞。


10.根据权利要求1至9中任一项所述的表达系统，其中所述鼠李糖诱导型启动子是rhaPBAD启动子。


11.根据权利要求10所述的表达系统，其中所述rhaPBAD启动子包含下述核苷酸序列：
CACCACAATTCAGCAAATTGTGAACATCATCACGTTCATCTTTCCCTGGTTGCCAATGGCCCATTTTCCTGTCAGTAACGAGAAGGTCGCGAATTCAGGCGCTTTTTAGACTGG(SEQIDNO：4)。


12.根据权利要求1至11中任一项所述的表达系统，其中所述有缺陷的鼠李糖分解代谢途径是由编码参与所述鼠李糖分解代谢途径的多肽的基因的失活引起的。


13.根据权利要求12所述的表达系统，其中参与所述鼠李糖分解代谢途径的所述多肽是L-鼠李树胶糖激酶(RhaB)。


14.根据权利要求1至13中任一项所述的表达系统，其中所述大肠杆菌细胞包含有缺陷的鼠李糖转运蛋白(rhaT)基因。


15.根据权利要求1至14中任一项所述的表达系统，其中所述大肠杆菌细胞包含有缺陷的麦芽糖转运蛋白亚基(malE)基因。


16.根据权利要求1至15中任一项所述的表达系统，其中所述大肠杆菌细胞表达融合至亲和标签的亮氨酸/异亮氨酸/缬氨酸转运蛋白亚基(LivK)。


17.根据权利要求16所述的表达系统，其中所述亲和标签为组氨酸标签。


18.根据权利要求1至17中任一项所述的表达系统，其中所述大肠杆菌细胞包含有缺陷的sulA基因。


19.一种生产白喉毒素多肽或其突变形式的方法，所述方法包括：
(a)在含有除鼠李糖以外的碳源的培养基中培养权利要求1至18中任一项所述的大肠杆菌细胞，直至在600nm处的光密度(OD600)达到至少大约150；
(b)向培养物中添加鼠李糖，并用含有碳源的溶液向所述培养物进料足以产生所述白喉毒素多肽或其突变形式的一段时间；以及
(c)收集从所述细胞的周质产生的白喉毒素多肽或其突变形式。


20.根据权利要求19所述的方法，其中进行所述培养步骤(a)直至OD600达到至少大约180或OD600达到大约180至大约220。


21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述培养基包含大约0.1g/L至大约100g/L，或大约5g/L至大约50g/L的酵母提取物。


22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中所述培养基包含浓度为至少大约0.001g/L的铁源。


23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其中所述培养步骤(a)的长度为大约24小时至大约32小时，或大约26小时至大约30小时，例如大约28小时。


24.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，其中所述培养步骤(a)包括第一阶段和第二阶段。


25.根据权利要求24所述的方法，其中在所述第一阶段，所述培养基中包含浓度为大约10g/L至大约30g/L或大约20g/L的...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·马森，M·阿保尔，MA·高里艾特，
申请(专利权)人：加拿大国家研究委员会，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA