【技术实现步骤摘要】
一种双启动子表达载体及其构建方法
本申请属于基因工程
，具体涉及一种能同时在原核及哺乳动物细胞中分别表达目的基因的双启动子表达载体及其构建方法专利申请。
技术介绍
基因工程技术常规应用中，通过将人为获取的外源目的基因与载体在体外进行重组，然后将重组载体导入到受体细胞并使该目的基因在受体细胞中进行正常的复制、转录和翻译，进而可对目的基因功能进行深入分析和研究。基于这一原理，基因工程技术在医药学领域已经得到广泛应用，如生产重组蛋白药物、基因治疗等。现有技术中，利用基因工程进行重组蛋白药物生产时，依据受体细胞基因组差异，可将蛋白表达系统分为两类：真核表达系统和原核表达系统，其中真核表达系统如哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞等；原核表达系统如大肠杆菌等。其中哺乳动物和大肠杆菌表达系统是现有重组蛋白药物制备中最为常用和最为主要的表达系统。统计表明，现有80%以上批准上市的重组蛋白药物是在这两个表达系统生产的。现有技术中，用于表达重组蛋白的哺乳动物细胞主要包括：中国仓鼠卵巢细胞（Chineseham...
【技术保护点】
1.一种双启动子表达载体，其特征在于，该载体基因组中包含有原核启动子T7序列、核糖体结合位点和T7终止序列；/n以真核表达载体为出发载体，利用基因工程技术构建获得；/n所构建的双启动子表达载体中，T7启动子序列位于出发载体的真核表达载体的启动子下游，核糖体结合位点位于T7启动子序列下游，T7终止序列位于出发载体的真核表达载体筛选标记下游；/n具体构建时，通过将原核启动子T7序列、核糖体结合位点RBS和T7终止序列或者启动子T7序列与核糖体结合位点RBS的连接序列、T7终止序列重组至真核表达载体构建获得；/n所述启动子T7序列为：TAATACGACTCACTATA，/n所述R...
【技术特征摘要】
1.一种双启动子表达载体，其特征在于，该载体基因组中包含有原核启动子T7序列、核糖体结合位点和T7终止序列；
以真核表达载体为出发载体，利用基因工程技术构建获得；
所构建的双启动子表达载体中，T7启动子序列位于出发载体的真核表达载体的启动子下游，核糖体结合位点位于T7启动子序列下游，T7终止序列位于出发载体的真核表达载体筛选标记下游；
具体构建时，通过将原核启动子T7序列、核糖体结合位点RBS和T7终止序列或者启动子T7序列与核糖体结合位点RBS的连接序列、T7终止序列重组至真核表达载体构建获得；
所述启动子T7序列为：TAATACGACTCACTATA，
所述RBS序列为：GAAGGA；
所述启动子T7序列与核糖体结合位点RBS的连接序列如SEQIDNO.1所示，具体为：TAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACC；
所述T7终止序列为如SEQIDNO.2所示，具体为：
CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG。
2.权利要求1所述双启动子表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）获得启动子T7序列、核糖体结合位点RBS、T7终止序列，或者启动子T7序列与核糖体结合位点RBS的连接序列、T7终止序列，备用；
（2）以真核表达载体为出发载体，利用基因工程技术将启动子T7序列、核糖体结合位点RBS和T7终止序列或者启动子T7序列与核糖体结合位点RBS的连接序列、T7终止序列重组至真核表达载体构建获得。
3.如权利要求1要求所述双启动子表达载体，其特征在于，所述真核表达载体，具体构建时，以pIRES-neo、pIRES-neo2、pIRES-neo3、pEGFP-C1、pcDNA1.1或pCHO1.0这些真核表达载体为出发载体。
4.利用权利要求3所述双启动子表达载体所构建的重组载体，其特征在于，该重组载体以pIRES-neo作为出发载体、以EGFP基因或ASFVp54基因作为目的基因，具体通过如下步骤构建获得：
（1）针对目的基因，设计引物并进行PCR扩增
针对EGFP基因，以pEGFP-C1质粒中的EGFP基因序列作为目的基因，PCR扩增时设计引物P1、P2如下：
P1：5′-CCGGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′，
P2：5′-CTAGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA-3′；
针对ASFVp54基因，所述ASFVp54基因序列如SEQIDNO.3所示，具体为：<...
【专利技术属性】
技术研发人员：王小引，王天云，易丹丹，许重洁，苗馨之，张伟莉，杨雯雯，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南;41
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