无细胞表达rhUTI蛋白系统及生产rhUTI蛋白的方法技术方案

本申请提供了一种无细胞表达rhUTI蛋白系统及生产rhUTI蛋白的方法。所述无细胞表达rhUTI蛋白系统包括如下成分：无细胞蛋白表达体系、表达质粒；所述无细胞蛋白表达体系包括细胞提取物、补充体系；所述补充体系包括：第一缓冲液或其功能等同体、镁盐或其功能等同体、钾盐或其功能等同体、草酸盐或其功能等同体、氨基酸或氨基酸混合物或其功能等同体、核苷酸混合物或其功能等同体；所述表达质粒含有密码子优化的rhUTI基因。

Cell free expression of rhuti protein system and its production

【技术实现步骤摘要】
无细胞表达rhUTI蛋白系统及生产rhUTI蛋白的方法
本申请涉及生物
，具体涉及无细胞表达rhUTI蛋白系统及生产rhUTI蛋白的方法。
技术介绍
人尿胰蛋白酶抑制剂(humanUrinarytrypsininhibitor，以下简称为hUTI)最初是从新鲜人尿中提取的一种能抑制多种蛋白水解酶活力的糖蛋白，也称为乌司他丁或尿抑素。hUTI存在于正常的人的尿液和血液中，由a-microglobulinprecursor(AMBP)基因编码，含有两个Kunitz型结构域，对胰蛋白酶(trypsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、纤溶酶(plasmin)等在内的多种蛋白酶具有较强的抑制作用。此外hUTI还可通过抑制脂多糖诱导的细胞因子合成发挥抗炎作用；对肿瘤细胞浸润和转移具有抑制作用。1909年，Beuer和Reich首次报道了人体尿液中存在胰蛋白酶抑制剂。1985年从人尿中提取的hUTI首次在日本上市，其主要适应症为胰腺炎和休克所致的急性循环衰竭。1999年广东天普生化医药公司在国内推出“注射用尿抑素”，填补了国内的空白。目前，临床上hUTI被广泛用于治疗急性胰腺炎、慢性胰腺炎的急性发作、急性循环衰竭、弥散性血管内凝血(DIC)，肿瘤、休克和外科手术中辅助用药，防治顺铂化疗时对肾功能的损伤，AIDS的辅助治疗以及先兆流产的预防和治疗等。目前，市场上商业化的hUTI制剂产品都从人尿中提取。研究表明，利用大肠杆菌(E.coli)表达的重组人尿胰蛋白酶抑制剂(RecombinantHumanUrinarytrypsininhibitor，rhUTI)也同样对胰蛋白酶具有抑制作用。由于利用基因工程技术表达重组蛋白可以避免从尿液中提取蛋白存在的来源限制、样品污染、后提取工艺复杂等，目前已成为研究热点。然而，目前利用基因工程手段从E.coli中获得的rhUTI产量低，难以满足商业化要求。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本申请采用下述技术方案：本申请的第一个方面提供了一种无细胞表达rhUTI蛋白系统，所述无细胞表达rhUTI蛋白系统包括如下成分：无细胞蛋白表达体系、表达质粒；所述无细胞蛋白表达体系包括细胞提取物、补充体系；所述补充体系包括：第一缓冲液或其功能等同体、镁盐或其功能等同体、钾盐或其功能等同体、草酸盐或其功能等同体、氨基酸或氨基酸混合物或其功能等同体、核苷酸混合物或其功能等同体；所述表达质粒含有密码子优化的rhUTI基因，所述基因序列如SEQIDNO.1所示。优选地，所述细胞提取物选自大肠杆菌细胞提取物、酵母细胞提取物、小麦胚芽提取物、昆虫细胞提取物、兔网织红细胞提取物、CHO细胞提取物中的任意一种或几种的任意组合。优选地，所述第一缓冲液的摩尔浓度为2～100mM；或/和所述镁盐中含有的镁离子的摩尔浓度为0.5～20mM；或/和所述钾盐中含有的钾离子的摩尔浓度为100～350mM；或/和所述草酸盐的摩尔浓度为0.5～10mM；或/和所述氨基酸或氨基酸混合物的摩尔浓度为1～3mM；或/和所述核苷酸混合物的摩尔浓度为0.5～1.5mM。优选地，所述第一缓冲液为磷酸盐缓冲液；或/和所述镁盐为谷氨酸镁或/和醋酸镁；或/和所述钾盐为谷氨酸钾或/和醋酸钾；或/和所述草酸盐为草酸钾或/和草酸钠；或/和所述氨基酸或氨基酸混合物为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸二十种氨基酸中的至少一种或多种的混合；或/和所述核苷酸混合物为核苷三磷酸NTP或核苷酸NMP。优选地，所述核苷三磷酸NTP包括如下任一组合：组合A：腺苷三磷酸ATP、鸟苷三磷酸GTP、尿苷三磷酸UTP和胞苷三磷酸CTP；组合B：腺苷三磷酸ATP和鸟苷三磷酸GTP。优选地，所述核苷酸NMP包括如下任一组合：组合C：腺嘌呤核苷酸AMP、鸟嘌呤核苷酸GMP、尿嘌呤核苷酸UMP和胞嘌呤核苷酸CMP；组合D：腺嘌呤核苷酸AMP和鸟嘌呤核苷酸GMP。优选地，所述补充体系还包括全氟化碳乳剂或其功能等同体。优选地，所述全氟化碳乳剂选自Fluosol、乳剂二号、Perftoran、Oxypherol、Oxyfluor、TherOx、(Oxygent)AF0144、FlutecPP9中的任意一种或多种的组合。优选地，所述密码子优化的rhUTI基因的N端还含有增强表达序列。优选地，所述增强表达序列的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，SEQIDNO.2序列为：TTCAGTCAGCGGAAGGAGATCACGGATGGGTAGTAGTCACCACCACCACCACCATTCGTCG。本专利技术的第二个方面提供了一种无细胞表达rhUTI蛋白系统生产rhUTI蛋白的方法，至少包括如下步骤：表达质粒的构建；配制无细胞蛋白表达体系；纯化获得的蛋白。优选地，所述表达质粒的构建的步骤如下：将待表达的蛋白基因进行密码子优化后，与增强表达序列一起通过Gibson组装连接到表达载体中，将其转化至大肠杆菌感受态细胞中，筛选重组子测序，获得表达质粒。优选地，所述配制无细胞蛋白表达体系的步骤如下：将表达质粒加入无细胞蛋白表达体系中进行表达。优选地，所述表达质粒含有密码子优化的rhUTI基因，所述基因序列如SEQIDNO.1所示。优选地，所述密码子优化的rhUTI基因的N端还含有增强表达序列。优选地，所述增强表达序列的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，SEQIDNO.2序列为：TTCAGTCAGCGGAAGGAGATCACGGATGGGTAGTAGTCACCACCACCACCACCATTCGTCG。优选地，所述表达所需要的温度为15-37℃，所需要的时间为2-24h。更优选地，所述表达所需要的温度为20-30℃，所需要的时间为8-20h。再进一步优选地，所述表达所需要的温度为25℃，所需要的时间为18h。本申请实施例采用的上述至少一个技术方案能够达到以下有益效果：1、本申请使用无细胞蛋白合成系统大大简便了操作过程且降低了成本，通过密码子优化和添加增强表达的序列大大提高了重组rhUTI蛋白在无细胞蛋白表达系统中的表达量。2、本申请采用基因工程技术，成功获得重组rhUTI蛋白，可以避免传统方法中出现的原料来源有限、采集困难及纯化过程复杂，除此之外还存在样品污染等潜在风险。3、采用本申请的方法可以大大降低生产成本，简化生产工艺。附图说明此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无细胞表达rhUTI蛋白系统，其特征在于，所述无细胞表达rhUTI蛋白系统包括如下成分：/n无细胞蛋白表达体系、表达质粒；/n所述无细胞蛋白表达体系包括细胞提取物、补充体系；/n所述补充体系包括：第一缓冲液或其功能等同体、镁盐或其功能等同体、钾盐或其功能等同体、草酸盐或其功能等同体、氨基酸或氨基酸混合物或其功能等同体、核苷酸混合物或其功能等同体；/n所述表达质粒含有密码子优化的rhUTI基因，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种无细胞表达rhUTI蛋白系统，其特征在于，所述无细胞表达rhUTI蛋白系统包括如下成分：
无细胞蛋白表达体系、表达质粒；
所述无细胞蛋白表达体系包括细胞提取物、补充体系；
所述补充体系包括：第一缓冲液或其功能等同体、镁盐或其功能等同体、钾盐或其功能等同体、草酸盐或其功能等同体、氨基酸或氨基酸混合物或其功能等同体、核苷酸混合物或其功能等同体；
所述表达质粒含有密码子优化的rhUTI基因，所述基因序列如SEQIDNO.1所示。


2.根据权利要求1所述的无细胞表达rhUTI蛋白系统，其特征在于，所述细胞提取物选自大肠杆菌细胞提取物、酵母细胞提取物、小麦胚芽提取物、昆虫细胞提取物、兔网织红细胞提取物、CHO细胞提取物中的任意一种或几种的任意组合。


3.根据权利要求1所述的无细胞表达rhUTI蛋白系统，其特征在于，所述第一缓冲液的摩尔浓度为2～100mM；或/和
所述镁盐中含有的镁离子的摩尔浓度为0.5～20mM；或/和
所述钾盐中含有的钾离子的摩尔浓度为100～350mM；或/和
所述草酸盐的摩尔浓度为0.5～10mM；或/和
所述氨基酸或氨基酸混合物的摩尔浓度为1～3mM；或/和
所述核苷酸混合物的摩尔浓度为0.5～1.5mM。


4.根据权利要求1所述的无细胞表达rhUTI蛋白系统，其特征在于，所述第一缓冲液为磷酸盐缓冲液；或/和
所述镁盐为谷氨酸镁或/和醋酸镁；或/和
所述钾盐为谷氨酸钾或/和醋酸钾；或/和
所述草酸盐为草酸钾或/和草酸钠；或/和
所述氨基酸或氨基酸混合物为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸二十种氨基酸中的至少一种或多种的混合；或/和
所述核苷酸混合物为核苷三磷酸NTP或核苷酸NMP。


5.根据权利要求4所述的无细胞表达rhUTI蛋白系统，其特征在于，所述核苷三磷酸NTP包括如下任一组合：
组合A：腺苷三磷酸ATP、鸟苷三磷酸GTP、尿苷三磷酸UTP和胞苷三磷酸CTP；
组合B：腺苷三磷酸ATP和鸟苷三磷酸GTP。


6.根据权利要求4所述的无细胞表达rhUTI蛋白系统，其特征在于，所述核苷酸NMP包括如下任一组合：
组合C：腺嘌呤核苷酸AMP、鸟嘌呤核苷酸GMP、尿嘌呤核苷酸UMP和胞嘌呤核苷酸CMP；
组合D：腺嘌呤核苷酸AMP和鸟嘌呤核苷酸GMP。

【专利技术属性】
技术研发人员：庄淼，杨修竹，王丹丹，贺亮，崔金辉，甘明哲，
申请(专利权)人：苏州珀罗汀生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32