一种DNA复合水凝胶及其制备方法技术

本申请涉及生物技术领域，具体涉及DNA复合水凝胶及其制备方法。本申请将质量分数为0.5％～4％黏土、质量分数为0.2％～30％的含功能化基团的高分子化合物、浓度10～400ng/μL的DNA模板在较低温度下混合均匀，较高温度下聚合，从而形成了DNA复合水凝胶。本申请的DNA复合水凝胶既可以保护DNA模板，又可以提高无细胞蛋白表达中DNA模板的局部有效浓度，进而提高了蛋白产量。同时该水凝胶可以重复使用数次，进一步降低了反应成本。

【技术实现步骤摘要】
一种DNA复合水凝胶及其制备方法
本申请涉及生物
，具体涉及用于无细胞蛋白表达的DNA复合水凝胶及其制备方法。
技术介绍
现有的蛋白质制备方法多是以细胞作宿主在活细胞里进行合成的，但其具有很多缺点：操作繁琐、周期长、合成的蛋白质种类极其有限等。无细胞蛋白质合成(Cell-freeProteinSynthesis,CFPS)系统是以外源DNA或mRNA为模板，人工添加所需原料和能源物质，以细胞提取物为条件合成蛋白的体外基因表达系统，可以突破细胞限制，方便快捷的表达各种蛋白质。详言之，CFPS是以DNA为模板，在RNA聚合酶及转录因子等组分作用下，转录出相应的mRNA；以mRNA为模板，利用系统中的核糖体、调控因子、氨基酸底物、tRNA、能源物质等翻译取得合成蛋白质。CFPS相对于体内系统的独特优势在于直接利用可通过聚合酶链式反应(PCR)扩增线性DNA模板(linearDNAexpressiontemplates,LETs)的能力，且无需将目的基因构建到表达载体上，显着简化了CFPS的工作流程、缩短了蛋白质合成时间。基于LETs的CFPS成为高通量生产和蛋白质筛选的有效工具，它已经开始在各种领域证明其有用性，例如：蛋白质微阵列、克隆的功能基因组学等。但是由于与质粒相比，LETs对无细胞环境中天然核酸酶的易感性增加，导致了其具有较短寿命和较低的反应产率。为了提高LETs在CFPS中的寿命和蛋白质的反应产率，现有技术所采取的方法包含：(1)抑制或降低核酸酶的活性，保护线性DNA免受核酸酶的降解作用，提高模板的局部浓度。(2)使用已敲除编码核酸内切酶E基因(RNaseE)的菌株制备细胞提取物，延迟了mRNA分子被降解，来自PCR扩增得到的LETs表达的蛋白质水平变得与常规基于质粒的反应相当，但是存在的问题是该菌株生长缓慢，费时。(3)通过设计特殊引物将DNA线性片段形成了类似于质粒的环形DNA分子，提高了目的基因片段对核酸外切酶的抵御能力，但是成本昂贵。(4)Luo课题组将DNA水凝胶系统应用于CFPS，主要是将线性模板DNA分子与X形DNA(X-DNA)衔接，以产生用于组合的无细胞转录和翻译系统的DNA水凝胶；在小麦胚芽无细胞系统中，与可溶性DNA模板相比，此方法使得蛋白质产量提高了300倍，然而X-DNA合成成本昂贵。Luo课题组又专利技术了一种成本低廉的黏土水凝胶，通过质粒和黏土的静电相互作用将质粒吸附在表面，保护了质粒免受体系中核酸外切酶的作用，并且增强了转录和翻译过程，进而提高了蛋白的表达。该黏土水凝胶虽然价格低廉，但是具有触变性，在震荡过程中容易破碎，限制了该水凝胶模板的重复利用。基于上述缺点，本专利技术提供了一种DNA复合水凝胶的制备方法。该方法是在黏土存在的条件下，以氢键或配位作用与高分子聚合物形成物理交联的水凝胶，同时以静电相互作用负载DNA模板。该DNA复合水凝胶机械强度较高，可实现水凝胶模板的重复利用，进一步降低了反应成本
技术实现思路
针对上述缺点，本专利技术提供了一种DNA复合水凝胶的制备方法。本专利技术的目的是提供DNA复合水凝胶。本专利技术的再一目的是上述DNA复合水凝胶的制备方法。本专利技术的DNA复合水凝胶通过以下步骤制备而得：将质量分数为0.5％～4％黏土、质量分数为0.2％～30％的含功能化基团的高分子化合物、浓度10～400ng/μL的DNA模板在较低温度下混合均匀，较高温度下聚合，从而形成了DNA复合水凝胶。根据本专利技术的DNA复合水凝胶，其中，所述黏土可为锂藻土。根据本专利技术的DNA复合水凝胶，其中，所述黏土溶液的质量分数可为0.5％～4％。黏土对DNA复合水凝胶的机械性能有较好的改善，随着黏土的增加，DNA复合水凝胶的机械性能越好；但是当其到达峰值后，随着黏土水凝胶的增加，DNA复合水凝胶的机械性能越差，这是由于高浓度的黏土阻碍了高分子聚合物的形成水凝胶。根据本专利技术的DNA复合水凝胶，其中，所述含功能化基团的高分子化合物的功能化基团可选自丙烯酸酯基、酰胺、马来酰亚胺基团、乙烯砜基、氨基、叠氮基或巯基中的至少一种或多种的组合。根据本专利技术的DNA复合水凝胶，其中，含功能化基团的高分子化合物骨架可选为聚乙二醇或多肽；优选为聚乙二醇骨架，该骨架有良好的生物相容性，低细胞毒性，同时价格低廉。根据本专利技术的DNA复合水凝胶，其中，含功能化基团的高分子化合物可为线性或多臂聚乙二醇马来酰亚胺，线性或多臂聚乙二醇乙烯砜，线性或多臂聚乙二醇丙烯酸酯，线性或多臂聚乙二醇巯基，线性或多臂聚乙二醇胺，线性或多臂聚乙二醇活性酯。根据本专利技术的DNA复合水凝胶，其中，含功能化基团的高分子化合物可以通过共价作用形成水凝胶。根据本专利技术的DNA复合水凝胶，其中，含功能化基团的高分子化合物的质量分数为0.2％～30％。含功能化基团的高分子化合物当其质量分数小于0.2％时，无法成胶；当其质量分数大于0.2％时，随着其浓度的增加，其形成的DNA复合水凝胶的机械性能越好，但同时水凝胶的孔径越小。根据本专利技术的DNA复合水凝胶，其中，所述DNA模板包括环状双链DNA、线状双链dsDNA中的至少一种。根据本专利技术的DNA复合水凝胶，其中，所述DNA模板的浓度为10～400ng/μL。DNA模板其浓度对于复合水凝胶的应用有较大影响。例如当其应用到无细胞蛋白表达时，随着DNA模板DNA浓度的增加，蛋白表达量也增加。根据本专利技术的DNA复合水凝胶，其中，可对所述DNA模板进行修饰功能化基团，该修饰功能化基团的DNA模板可和含功能化基团的高分子化合物共价结合形成水凝胶。所述修饰功能化基团的DNA的功能化基团选自酰胺、巯基、氨基或叠氮基中的任意一种或多种的组合。根据本专利技术的DNA复合水凝胶，其中，所述DNA复合水凝胶反应条件温和，反应缓冲液为盐溶液，反应缓冲液优选为：焦磷酸钠缓冲液，磷酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，Hepes缓冲液；反应pH值为：5.8-10,优选为：5.8-7.4。根据本专利技术的DNA复合水凝胶，其中，所述DNA复合水凝胶在室温下即可成胶，加热可促进其成胶速度。DNA复合水凝胶的制备方法是在黏土存在的条件下，以氢键或配位作用与高分子聚合物形成物理交联的水凝胶，同时以静电相互作用负载DNA模板。该DNA复合水凝胶制备步骤简单，机械性能优异，价格低廉，可实施性高。同时该水凝胶可抵御核酸外切酶的切割，保护线性模板，可用于无细胞蛋白表达中，提高蛋白表达量；并且这种水凝胶可重复利用，降低了蛋白表达成本。本专利技术提供了一种DNA复合水凝胶的制备方法，其合成方法简单，机械性能优异，并成功将上述的水凝胶应用到无细胞蛋白质的生产。该DNA复合水凝胶既可以对保护DNA模板，又可以提高无细胞蛋白表达中模板的局部有效浓度，进而提高了蛋白产量。同时该水凝胶可以重复使用数次，进一步降低了反应成本。本申请实施例采用的上述至少一个技术方案能够达到以下有益效果：附图说明此处所说明的附图用来提供对本申请的进本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA复合水凝胶，其特征在于，所述DNA复合水凝胶通过使用以下原料聚合而得：/n质量分数为0.5％～4％黏土溶液，质量分数为0.2％～30％的含功能化基团的高分子化合物，以及浓度10～400ng/μL的DNA模板。/n

【技术特征摘要】
1.一种DNA复合水凝胶，其特征在于，所述DNA复合水凝胶通过使用以下原料聚合而得：
质量分数为0.5％～4％黏土溶液，质量分数为0.2％～30％的含功能化基团的高分子化合物，以及浓度10～400ng/μL的DNA模板。


2.根据权利要求1所述的DNA复合水凝胶，其特征在于，所述黏土为锂藻土。


3.根据权利要求1所述的DNA复合水凝胶，其特征在于，所述含功能化基团的高分子化合物的功能化基团为选自丙烯酸酯基、酰胺、马来酰亚胺基团、乙烯砜基、氨基、叠氮基或巯基中的至少一种或多种的组合。


4.根据权利要求1所述的DNA复合水凝胶，其特征在于，所述含功能化基团的高分子化合物骨架为聚乙二醇或多肽。


5.根据权利要求1所述的DNA复合水凝胶，其特征在于，所述含功能化基团的高分子化合物为线性或多臂聚乙二醇马来酰亚胺，线性或多臂聚乙二醇乙烯砜，线性或多臂聚乙二醇丙烯酸酯，线性或多臂聚乙二醇巯基，线性或多臂聚乙二醇胺，线性或多臂聚乙二醇活性酯。


6.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨修竹，贺亮，庄淼，杜静，张忆恒，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：苏州珀罗汀生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32