一种新型转座子突变株文库的构建系统技术方案

本发明专利技术涉及一种新型转座子突变株文库的构建系统，构建步骤如下：⑴构建一个在ITRs区域中额外添加了转座酶基因tnpA的新型转座子质粒载体；⑵在ITRs区域中额外添加的转座酶基因tnpA能够受到阿拉伯糖启动子基因araBAD和阿拉伯糖抑制蛋白基因araC调控；⑶获得一个含有转座子的不同物种的转座子突变株；⑷该转座子突变株在基因组的任一位置上具有一个转座子插入序列；⑸随机获得全基因组范围内多种插入基因形式的转座子突变株文库。本发明专利技术构建系统可以系统高效地得到覆盖全基因组的革兰氏阴性菌转座子突变株文库，有助于研究基因组注释和功能分析。

【技术实现步骤摘要】
一种新型转座子突变株文库的构建系统
本专利技术属于基因突变
，尤其是一种新型转座子突变株文库的构建系统。
技术介绍
随着高通量测序技术的迅猛发展，越来越多的生物基因组注释结果表明：转座子几乎存在于所有生物的基因组中，是大多数生物基因组的重要组分。其中，Tc1/Mariner转座子是自然界中分布最广泛的一类DNA转座子超家族，在自然界已经发现14个有活性的Tc1/Mariner转座子(如Minos，Mos1等)，另外通过分子重构也获得高活性的人工转座子，如睡美人转座子(SleepingBeauty，SB)。SB和Mos1等转座子作为基因转移载体已被广泛应用于转基因、基因捕获和基因治疗等领域的研究中，并取得了很好的应用效果。Tc1/Mariner转座子家族成员的全长一般为1300～2400bp，其中包含一个单基因编码的转座酶，侧翼为反向末端重复序列(invertedterminalrepeats，ITRs)。当转座酶与ITRs结合时，可以促进转座的发生。Tc1/Mariner作为一种重要的基因工程工具，可以利用它们转座序列和转座酶可以分离的特征去构建转座子系统。当前转座子文库系统一般采用接合转移的方式进行构建，但以此方法构建出来的转座子文库存在效率偏低，操作繁琐且文库容量小等缺点。为解决当前文库构建时存在的问题，使得转座子使用更加广泛，本专利技术提供了一种新型转座子突变文库的构建系统，此方法不要求接合转移效率，只需一个含有转座子的突变株，就能得到几乎覆盖全基因组范围内的转座子突变文库。这种新型转座子文库的构建系统不仅可以增大转座突变的多样性，更有助于菌株插入位置的确定。通过检索，尚未发现与本专利技术专利申请相关的专利公开文献。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种新型转座子突变株文库的构建系统和转座子突变文库。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种新型转座子突变株文库的构建系统，构建步骤如下：⑴模仿天然的转座子质粒，人工构建了一个在ITRs区域中额外添加了转座酶基因tnpA的新型转座子质粒载体；⑵在ITRs区域中额外添加的转座酶基因tnpA受到阿拉伯糖启动子基因araBAD和阿拉伯糖抑制蛋白基因araC调控；⑶先将转座子质粒化转到E.coliS17-1λpir中，再利用常见的接合转移mating方法，获得一个含有转座子的不同物种的转座子突变株；⑷该转座子突变株在基因组的任一位置上具有一个转座子插入序列，该插入序列包括：两端的ITRs区域，阿拉伯糖启动子基因araBAD，阿拉伯糖抑制蛋白基因araC和转座酶基因tnpA；⑸扩增培养一个转座子突变株，在细胞数达到1012cfu/mL时，添加终浓度为2mg/ml的阿拉伯糖，诱导培养2h使转座子跳跃，随机获得全基因组范围内多种插入基因形式的转座子突变株文库。而且，所述步骤⑴中转座子质粒载体具有如下特征：①去除了tnpA转座酶基因的pKKma转座子质粒基因序列；②在ITRs区域中加入了阿拉伯糖启动子基因araBAD和阿拉伯糖抑制蛋白基因araC；③在ITRs区域中加入了受阿拉伯糖调控的转座酶基因tnpA。而且，所述pKKma转座子质粒的核苷酸序列为SEQIDNO.1。而且，所述步骤⑴中tnpA转座酶的基因的核苷酸序列为SEQIDNO.3。而且，所述步骤⑴中新型转座子质粒载体的核苷酸序列为SEQIDNO.4。而且，所述步骤⑶中先将转座子质粒载体化转到E.coliS17-1λpir中，获得含有稳定表达且受阿拉伯糖调控的转座酶基因tnpA的大肠杆菌菌株，再利用常见的接合转移mating方法，获得一个含有转座子的其他物种的转座子突变株。而且，所述步骤⑸中能够根据构建文库的需求，控制转座子突变株的菌浓和体积，且转座酶诱导转座子跳跃的过程是能够调控的。而且，所述步骤⑵中编码阿拉伯糖启动子基因araBAD和阿拉伯糖抑制蛋白基因araC的核苷酸序列为SEQIDNO.2。利用如上所述的新型转座子突变株文库的构建系统获得的新型转座子突变文库。本专利技术取得的优点和积极效果为：1、构建转座子突变株文库现在被广泛应用于基因组功能注释和功能分析中。目前，转座子文库系统一般采用接合转移的方式进行构建，但以此方法构建出来的转座子文库效率偏低，一般转座效率只能达到10-3-10-4，而且得到的文库容量较小，不能覆盖细菌的全基因组范围。本专利技术提供了一种新型转座子突变文库的构建系统，首次将转座酶基因tnpA克隆到反向末端重复序列(invertedterminalrepeats，ITRs)区域中并使其表达受到阿拉伯糖启动子基因araBAD和阿拉伯糖抑制蛋白基因araC的调控，采用“两步法”，首先通过接合转移获得一个含有转座子的突变株，以此突变株为出发菌株，在阿拉伯糖诱导下使ITRs跳跃插入到不同基因上，得到种类丰富的获得多种插入基因形式的转座子突变文库，此方法不要求接合转移效率，只需一个含有转座子的突变株，就能得到几乎覆盖全基因组范围内的转座子突变文库。这种新型转座子文库的构建系统不仅可以增大转座突变的多样性，更有助于菌株插入位置的确定。2、本专利技术构建系统可以系统高效地得到覆盖全基因组的革兰氏阴性菌转座子突变株文库，有助于研究革兰氏阴性菌基因组注释和功能分析。附图说明图1为本专利技术中载体质粒pLDH2001的遗传图谱；其中，KpnI和PstI是连接pKKma△tnpA质粒和纯化后的受到阿拉伯糖调控的mariner转座酶基因tnpA的两个酶切位点。具体实施方式下面结合实施例，对本专利技术进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本专利技术的保护范围。本专利技术中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本专利技术中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本专利技术所用各物质质量均为常规使用质量。一种新型转座子突变株文库的构建系统，构建步骤如下：⑴模仿天然的转座子质粒，人工构建一个在ITRs区域中额外添加了转座酶基因tnpA的新型转座子质粒载体，其遗传图谱如图1所示。；⑵在ITRs区域中额外添加的转座酶基因tnpA能够受到阿拉伯糖启动子基因araBAD和阿拉伯糖抑制蛋白基因araC调控；⑶先将转座子质粒化转到E.coliS17-1λpir中，再利用常见的接合转移mating方法，获得一个含有转座子的不同物种的转座子突变株；⑷该转座子突变株在基因组的任一位置上具有一个转座子插入序列，该插入序列包括：两端的ITRs区域，阿拉伯糖启动子基因araBAD，阿拉伯糖抑制蛋白基因araC和转座酶基因tnpA；⑸扩增培养一个转座子突变株，在细胞数达到1012cfu/mL时，添加终浓度为2mg/ml的阿拉伯糖，诱导培养2h使转座子跳跃，随机获得全基因组范围内多种插入基因形式的转座子突变株文库。较优地，所述步骤⑴本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型转座子突变株文库的构建系统，其特征在于：构建步骤如下：/n⑴模仿天然的转座子质粒，人工构建一个在ITRs区域中额外添加了转座酶基因tnpA的新型转座子质粒载体；/n⑵在ITRs区域中额外添加的转座酶基因tnpA能够受到阿拉伯糖启动子基因araBAD和阿拉伯糖抑制蛋白基因araC调控；/n⑶先将转座子质粒化转到E.coli S17-1λpir中，再利用接合转移mating方法，获得一个含有转座子的不同物种的转座子突变株；/n⑷该转座子突变株在基因组的任一位置上具有一个转座子插入序列，该插入序列包括：两端的ITRs区域，阿拉伯糖启动子基因araBAD，阿拉伯糖抑制蛋白基因araC和转座酶基因tnpA；/n⑸扩增培养一个转座子突变株，在细胞数达到10

【技术特征摘要】
1.一种新型转座子突变株文库的构建系统，其特征在于：构建步骤如下：
⑴模仿天然的转座子质粒，人工构建一个在ITRs区域中额外添加了转座酶基因tnpA的新型转座子质粒载体；
⑵在ITRs区域中额外添加的转座酶基因tnpA能够受到阿拉伯糖启动子基因araBAD和阿拉伯糖抑制蛋白基因araC调控；
⑶先将转座子质粒化转到E.coliS17-1λpir中，再利用接合转移mating方法，获得一个含有转座子的不同物种的转座子突变株；
⑷该转座子突变株在基因组的任一位置上具有一个转座子插入序列，该插入序列包括：两端的ITRs区域，阿拉伯糖启动子基因araBAD，阿拉伯糖抑制蛋白基因araC和转座酶基因tnpA；
⑸扩增培养一个转座子突变株，在细胞数达到1012cfu/mL时，添加终浓度为2mg/ml的阿拉伯糖，诱导培养2h使转座子跳跃，随机获得全基因组范围内多种插入基因形式的转座子突变株文库。


2.根据权利要求1所述的新型转座子突变株文库的构建系统，其特征在于：所述步骤⑴中转座子质粒载体具有如下特征：
①去除了tnpA转座酶基因的pKKma转座子质粒基因序列；
②在ITRs区域中加入了阿拉伯糖启动子基因araBAD和阿拉伯糖抑制蛋白基因araC；
③在ITRs区域中加入了受阿拉伯糖调控的转座酶基因tnpA。


3.根据权利要求2所述的新型转座子突...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨洪江，李东航，秦旭颖，庞文静，张志强，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12