本发明专利技术涉及菌株DNA的提取技术领域，具体涉及快速简易提取厌氧真菌DNA的方法及应用。所述的方法包括如下步骤：(1)菌株培养；(2)收集菌体；(3)破壁；(4)抽提DNA；(5)沉淀DNA；所述的厌氧真菌DNA提取方法，提取DNA的纯度和浓度高，且采用液氮研磨冷冻和钢珠振荡破碎厌氧真菌细胞壁，破碎过程中所需样本量较少，不易损失样本，破壁效果良好，简单易行。同时，本发明专利技术所述的抽提缓冲液配方简单，成本低廉，提取DNA的效果良好；采用本方法提取厌氧真菌的DNA操作简易，实验重复性好，能够获得高质量的DNA，对于促进厌氧真菌的研究具有重大意义。
【技术实现步骤摘要】
快速简易提取厌氧真菌DNA的方法及应用
本专利技术涉及菌株DNA的提取
，具体涉及快速简易提取厌氧真菌DNA的方法及应用。
技术介绍
厌氧真菌的DNA提取是厌氧真菌分子生物学研究中一项重要工作。目前，真菌基因组提取方法主要有CTAB法、SDS提取法、尿素提取法及酶解法等。上述提取方法的提取步骤大体相似，关键在于如何有效的破碎细胞壁。目前，常用的厌氧真菌细胞破壁的方法有(1)经典的液氮研磨法。(2)液氮冻融(和玻璃珠振荡)法。该方法使用液氮，增加了成本及设备要求；(3)酶解法。用于丝状真菌破壁的酶比较昂贵，在处理大量样品时很不经济；(4)化学试剂(氯化苄)法。化学试剂存在环保上的隐患。上述提取厌氧真菌DNA的方法大多为液氮研磨破碎厌氧真菌的细胞壁，但是破壁效果差，或用专用细胞破碎仪破碎厌氧真菌的细胞壁，然而细胞破碎仪的成本高，破壁过程繁琐，普及率不高。本领域技术人员最常用的真菌基因组提取方法是CTAB法，但CTAB法提取过程繁琐，所需试剂种类繁多，提取效果一般。针对上述技术问题，本领域技术人员研究出来了用于提取厌氧真菌DNA的试剂盒，提取效果较好，但是试剂盒的价格昂贵，且提取的次数有限，不能满足研究人员在研究过程中进行大量的实验或者是重复多次验证实验效果，且部分试剂盒在提取的过程中还需要补充配制加入指定试剂来提高提取效果。专利技术人在研究过程中发现，厌氧真菌由于其细胞壁含有几丁质，又称壳多糖，为N-乙酰葡糖胺通过β连接聚合而成的结构同多糖。其不溶于一般的弱无机酸或有机溶剂，且不溶于碱液中，只溶于强无机酸。使得真菌的细胞壁破壁困难，本领域技术人员在提取厌氧真菌DNA的时候因无法破壁而导致提取效果不好。针对上述技术问题，专利技术人为了更好地研究厌氧真菌的遗传信息，提取厌氧真菌基因组DNA。发现了一种适用于厌氧真菌基因组DNA提取的方法，所述的方法具有成本低、样本量少、提取快速、操作简便的特点，解决使用常规方法所获得的DNA样品提取时间长的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前提取厌氧真菌DNA技术的不足，提出的一种低成本的、所需样本量少、快速的、简便易行的、高效提取厌氧真菌DNA的新方法。快速简易提取厌氧真菌DNA的方法，所述的方法包括如下步骤：(1)菌株培养：将厌氧真菌接种在厌氧培养基里，加入复合抗生素，静置培养；(2)收集菌体：将步骤(1)得到的菌液离心，取菌丝体；(3)破壁：将步骤(2)得到的菌丝体被液氮快速研磨后取少量加入到离心管中，再加入钢珠，迅速冷却，振荡离心管，使厌氧真菌细胞壁破碎；(4)抽提DNA溶液：向步骤(3)得到的溶液中加入抽提缓冲液，振荡，恒温水浴，加入乙酸铵，混匀，冷却，离心，取上清液，弃沉淀物和钢珠；上清液用等体积的Tris饱和酚：氯仿：异戊醇溶液抽提2次，混匀，离心，去除杂蛋白；(5)沉淀DNA：取步骤(4)得到的上层水相至另一离心管中，加入异丙醇，混匀，低温放置以沉淀DNA；离心，弃上清，用乙醇洗涤沉淀，用无菌双蒸水溶解沉淀，即得厌氧真菌DNA。优选地，步骤(1)所述的厌氧培养基的配制步骤如下：酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，葡萄糖1.0g，NaHCO37.0g，刃天青(1.0g/L)1mL，L-半胱氨酸盐酸盐1.7g，晨饲前采集瘤胃液8000×g，4℃离心20min后的上清170mL，盐溶液I165mL，盐溶液II165mL，蒸馏水定容至1000mL；盐溶液I的配制步骤如下：NaCl6g，(NH4)2SO43g，KH2PO43g，CaCl2·2H2O0.4g，MgSO4·2H2O0.6g，蒸馏水定容至1000mL；盐溶液II配制步骤如下：K2HPO44g，蒸馏水定容至1000mL。优选地，步骤(1)厌氧真菌的接种量为10％v/v，复合抗生素的接种量为1％v/v，所述的复合抗生素具体为青霉素钠和硫酸链霉素，终浓度分别为1600IU/mL和2000IU/mL。优选地，步骤(2)所述的菌液离心的转速为5000g/min，离心时间为5min。优选地，步骤(3)所述的冷却是液氮快速研磨菌丝体后将少量被研磨的菌丝体(约0.1g)置于离心管中，再加入钢珠2颗，将离心管放在液氮中冷却，振荡离心管，振荡过程中离心管保持冷冻状态，振荡时间为3-5min。优选地，步骤(4)所述的抽提缓冲液的配制步骤如下：Tris(pH8.5)2.4228g，NaCl1.461g，乙二胺四乙酸二钠0.9306g，十二烷基硫酸钠2g，蒸馏水定容100mL。并用HCl调pH值至8.5。优选地，步骤(4)所述的乙酸铵加入量为浓度10M的乙酸铵200μL，Tris饱和酚：氯仿：异戊醇溶液的加入量是与上清液等体积。(Tris饱和酚：氯仿：异戊醇溶液的配制方法和体积比例是25mLTris饱和酚：24mL氯仿：1mL异丙醇)。优选地，步骤(5)所述的异丙醇加入量为上层水相的0.5-0.6倍体积，且所述的异丙醇于-20℃预冷。优选地，步骤(5)所述的无菌双蒸水的加入量为50μL。优选地，步骤(5)所述的乙醇加入量为1mL75％。本专利技术的有益效果是：本专利技术所述的厌氧真菌DNA提取方法，提取DNA的纯度和浓度高，且采用液氮研磨冷冻和钢珠振荡破碎厌氧真菌细胞壁，破碎的过程中所需样本量较少，不易损失样本，破壁效果良好，简单易行。同时，本专利技术所述的抽提缓冲液配方简单，成本低廉，提取DNA的效果良好。采用本方法提取厌氧真菌的DNA操作简易，实验重复性好，能够获得高质量的DNA，对于促进厌氧真菌的研究具有重大意义。说明书附图图1不同方法提取厌氧真菌总DNA的电泳图1.常用CTAB法；2.植物基因组试剂盒提取法；3.本专利技术的方法；4.FastDNA土壤试剂盒提取法具体实施方式为了便于理解本专利技术，下文将结合较佳的实施例对本专利技术作更全面、细致地描述，但本专利技术的保护范围并不限于以下具体的实施例。除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本专利技术的保护范围。除非另有特别说明，本专利技术中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。下述实施例中所使用的培养基如下：厌氧培养基配制步骤如下：酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，葡萄糖1.0g，NaHCO37.0g，刃天青(1.0g/L)1mL，L-半胱氨酸盐酸盐1.7g，晨饲前采集瘤胃液8000×g，4℃离心20min后的上清170mL，盐溶液I165mL，盐溶液II165mL，蒸馏水定容至1000mL。盐溶液I配制步骤如下：NaCl6g，(NH4)2SO43g，KH2PO43g，CaCl2·2H2O0.4g，MgSO4·2H2O0.6g，蒸馏水定容至1000mL。盐溶液II配制步骤如下：K2HPO44g，蒸馏水定容至1000mL。除氧。高温高压灭菌本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.快速简易提取厌氧真菌DNA的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：/n(1)菌株培养：将厌氧真菌接种在厌氧培养基里，加入复合抗生素，静置培养；/n(2)收集菌体：将步骤(1)得到的菌液离心，取菌丝体；/n(3)破壁：将步骤(2)得到的菌丝体被快速液氮研磨后取0.1-1g加入到离心管中，再加入钢珠，冷却，振荡离心管，振荡期间离心管保持冷冻状态，使厌氧真菌细胞壁破碎；/n(4)抽提DNA：向步骤(3)得到的溶液中加入抽提缓冲液，振荡，恒温水浴后，加入乙酸铵，混匀，冷却，离心，取上清液，弃沉淀物和钢珠；上清液用等体积的Tris饱和酚：氯仿：异戊醇溶液抽提2次，混匀，离心，去除杂蛋白；/n(5)沉淀DNA：取步骤(4)得到的上层水相至另一离心管中，加入异丙醇，混匀，低温放置以沉淀DNA；离心，弃上清，用乙醇洗涤沉淀，用无菌双蒸水溶解沉淀，即得厌氧真菌DNA。/n
【技术特征摘要】
1.快速简易提取厌氧真菌DNA的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
(1)菌株培养：将厌氧真菌接种在厌氧培养基里，加入复合抗生素，静置培养；
(2)收集菌体：将步骤(1)得到的菌液离心，取菌丝体；
(3)破壁：将步骤(2)得到的菌丝体被快速液氮研磨后取0.1-1g加入到离心管中，再加入钢珠，冷却，振荡离心管，振荡期间离心管保持冷冻状态，使厌氧真菌细胞壁破碎；
(4)抽提DNA：向步骤(3)得到的溶液中加入抽提缓冲液，振荡，恒温水浴后，加入乙酸铵，混匀，冷却，离心，取上清液，弃沉淀物和钢珠；上清液用等体积的Tris饱和酚：氯仿：异戊醇溶液抽提2次，混匀，离心，去除杂蛋白；
(5)沉淀DNA：取步骤(4)得到的上层水相至另一离心管中，加入异丙醇，混匀，低温放置以沉淀DNA；离心，弃上清，用乙醇洗涤沉淀，用无菌双蒸水溶解沉淀，即得厌氧真菌DNA。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的厌氧培养基的配制步骤如下：酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，葡萄糖1.0g，NaHCO37.0g，刃天青1.0g/L1mL，L-半胱氨酸盐酸盐1.7g，晨饲前采集瘤胃液8000×g，4℃离心20min后的上清170mL，盐溶液I165mL，盐溶液II165mL，蒸馏水定容至1000mL；盐溶液I的配制步骤如下：NaCl6g，(NH4)2SO43g，KH2PO43g，CaCl2·2H2O0.4g，MgSO4·2H2O0.6g，蒸馏水定容至1000mL；盐溶液II配制步骤如下：K2HPO44g，蒸馏水定容至1000mL。
【专利技术属性】
技术研发人员：魏亚琴，王霄霄，苟琦敏，
申请(专利权)人：甘肃省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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