一种质粒构建试剂盒、质粒构建方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种质粒构建试剂盒、质粒构建方法及其应用，所述试剂盒包括待组装的DNA片段F

A plasmid construction kit, plasmid construction method and its application

【技术实现步骤摘要】
一种质粒构建试剂盒、质粒构建方法及其应用
本专利技术属于合成生物学
，涉及一种质粒构建试剂盒、质粒构建方法及其应用。
技术介绍
近年来合成生物学迅速发展，在生物医药、能源和新材料等领域得到广泛的应用。超大质粒可以用于合成基因组的结构单元，服务于基因编辑、蛋白表达和抗体表达等技术，有助于进行代谢通路、基因功能、蛋白质功能和免疫治疗等方面的研究。但是，超大质粒、尤其是40kb以上的质粒的合成存在诸多困难，科学家们虽然提出了多种方法用于超大质粒的合成，但是普遍存在效率低下的问题。这就需要在超大质粒的合成和拼装技术上进行改进和突破。现阶段，体外大片段组装方法包括Gateway、In-fusion、Cold-fusion、T4DNApolymerase-basedLigaseIndependentCloning(LIC)、GoldenGate和GibsonAssembly等。其中，Gateway技术需要构建入门载体，耗时较长，成本较高；GoldenGate技术依赖于II型限制性内切酶和连接酶，不适用于存在上述酶的序列的合成，需要提前分析片段本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种质粒构建试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括待组装的DNA片段F

【技术特征摘要】
1.一种质粒构建试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括待组装的DNA片段Fn和载体；
所述载体包括中间载体和/或组装载体；
所述DNA片段F1的上游和DNA片段Fn的下游包含中间载体的同源臂；
所述DNA片段Fi的上游与DNA片段Fi-1的下游具有一段重叠的反向互补序列，所述DNA片段Fi的下游与DNA片段Fi+1的上游具有一段重叠的反向互补序列；
其中，n≥2且为偶数，1≤i≤n；
所述片段Fn为正向与反向互补相间的长引物；
所述试剂盒还包括大肠杆菌，所述大肠杆菌含有λ噬菌体Red重组系统的质粒。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA片段Fn的长度为52～73bp，优选为58～67bp；
优选地，所述重叠的反向互补序列的长度为19～32bp，优选为21～24bp；
优选地，所述中间载体包括PUC57-Amp。


3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括限制性内切酶、DNA外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶或重组酶中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述限制性内切酶包括EcoRV；
优选地，所述DNA外切酶包括T5DNA外切酶；
优选地，所述DNA聚合酶包括TaqDNA聚合酶；
优选地，所述DNA连接酶包括T4DNA连接酶；
优选地，所述重组酶包括T5核酸外切酶和高保真Taq酶。


4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阿拉伯糖、PCR缓冲液、dNTPs、重组缓冲液、酶切缓冲液或连接缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。


5.一种质粒的构建方法，其特征在于，所述方法采用如权利要求1-4任一项所述的试剂盒进行质粒构建。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)利用PCR将待组装的DNA片段Fn进行拼接，得到拼接产物；
(2)将步骤(1)获得的拼接产物与限制性酶切线性化的平末端中间载体进行重组或连接反应；
(3)将步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱佑民，杨平，孙健，柳伟强，刘敏祥，严成丽，邢妍婧，赵一凡，
申请(专利权)人：苏州泓迅生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32