一种调控驱动蛋白活性的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种调控驱动蛋白活性的方法及应用，属于生物技术领域，通过解析酶活性较低的驱动蛋白的晶体结构，通过序列、结构比对和功能验证最终确定酶活性关键调控位点，可用于离体或在体调控驱动蛋白活性。该方法可以有效解决现有技术中无法有效调控(降低与提高)驱动蛋白活性的技术难题，从而为体外或在体研究驱动蛋白功能提供强有力的技术和手段。

A method of regulating the activity of kinesin and its application

【技术实现步骤摘要】
一种调控驱动蛋白活性的方法及应用
本专利技术属于生物
，涉及一种调控驱动蛋白活性的方法及应用。
技术介绍
驱动蛋白在癌症、心血管疾病的发生发展中发挥重要作用。驱动蛋白是一类马达蛋白，水解ATP沿微管定向运动，将各种货物(如囊泡、线粒体等)运输至细胞内特定的位置。自1985年首次发现驱动蛋白以来，已经发现14个亚家族的45个成员。随着对驱动蛋白功能研究的逐渐深入，驱动蛋白功能异常与各种疾病(如肿瘤、神经退行性疾病和糖尿病等)的发生发展密切相关。一些驱动蛋白，如Eg5和CENPE等，被证实是有丝分裂的关键因子，而成为肿瘤靶向治疗的热点。2008年，一项前瞻性研究表明，驱动蛋白6(KIF6)基因rs20455位点(W719R)多态性与高加索人群的心血管疾病患病风险相关，而之后的几个大型临床研究也证实了该观点，推测其可能是心血管疾病的一个新的预测因子。这些研究表明驱动蛋白在许多疾病的发生发展过程中发挥重要作用。但是，目前缺乏调控驱动蛋白酶活性的技术手段，严重限制了驱动蛋白体外或在体功能的研究。目前针对驱动蛋白设计的药物主要集中于Eg5、CENPE等肿瘤相关驱动蛋白，并且主要是抑制剂，导致研究其它驱动蛋白功能缺乏相关药物辅助。大部分驱动蛋白基因敲除后导致胚胎致死，严重限制了在体研究驱动蛋白功能。目前常用两种方法来构建显性负性突变体，过表达从而在体内达到抑制其功能的目的：一种是构建马达区删除突变体，导致突变体不能水解ATP和结合微管；一种是将ATP结合位点关键氨基酸突变，导致突变体能够结合微管但不能水解ATP。然而这两种突变体的构建均只能够降低驱动蛋白酶活性，不能够提高驱动蛋白酶活性。所以，若能找到一种有效调控(降低与提高)驱动蛋白活性方法，可以为体外或在体研究驱动蛋白功能提供强有力的技术和手段，并将为各种疾病分子机制的探究提供新的技术手段和研究思路。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种调控驱动蛋白活性的方法及应用，该方法可以有效解决现有技术中无法有效调控(降低与提高)驱动蛋白活性的技术难题，从而为体外或在体研究驱动蛋白功能提供强有力的技术和手段。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术公开了一种调控驱动蛋白活性的方法，包括以下步骤：1)构建驱动蛋白马达区表达载体，然后进行表达和纯化；2)对构建的驱动蛋白马达区结晶和结构解析；3)通过对驱动蛋白马达区序列和结构进行比对，获得关键突变位点；4)构建点突变质粒，然后分别进行野生型和突变体的表达纯化，根据结果，通过突变上述关键位点调控驱动蛋白酶活性。优选地，通过将关键突变位点突变为不同氨基酸，能够在同一位点增加或降低酶活性。优选地，所述驱动蛋白为棉花驱动蛋白GhKCH2。进一步优选地，构建GhKCH2MD不同长度截短片段，经原核表达、纯化得到95％以上纯度的目的蛋白，然后筛选晶体并衍射，获得GhKCH2MD晶体结构。进一步优选地，棉花驱动蛋白GhKCH2的关键突变位点为Thr494。进一步优选地，将关键突变位点Thr494突变为丙氨酸，能够构建抑制驱动蛋白活性的显性负性突变体。进一步优选地，将关键突变位点Thr494突变为亮氨酸，能够构建提高驱动蛋白活性的显性负性突变体。本专利技术还公开了了采用上述方法构建得到的抑制驱动蛋白活性的显性负性突变体和提高驱动蛋白活性的显性负性突变体在体内或体外调控驱动蛋白活性的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术公开的调控驱动蛋白活性的方法，通过解析酶活性较低的驱动蛋白的晶体结构，通过序列、结构比对和功能验证最终确定酶活性关键调控位点，可用于离体或在体调控驱动蛋白活性。进一步地，本专利技术选择具有独特生化特性的棉花驱动蛋白GhKCH2(GenBankaccessionnumber:EF432568)，酶活性约为传统驱动蛋白的十分之一和不依赖于核苷酸的微管结合特性。进一步地，通过构建GhKCH2MD不同长度截短片段，经原核表达、纯化得到95％以上纯度的目的蛋白，然后筛选晶体并衍射，获得GhKCH2MD晶体结构在获得GhKCH2MD晶体结构后通过结构比对，发现其核苷酸结合口袋构象变化较大，深入分析发现Thr494可能是其构象改变，进而导致酶活性较低的原因，再通过定点突变和酶活性测定进行验证，确认Thr494位点是调控酶活性的关键位点。本专利技术还公开了获得的关键位点的应用，通过将关键位点突变为丙氨酸，构建显性负性突变体，从而达到在体或体外抑制驱动蛋白活性的目的，通过将关键位点突变为亮氨酸，构建显性负性突变体，从而达到在体或体外提高驱动蛋白活性的目的。通过将该位点突变为不同氨基酸，可以做到在同一位点增加或降低酶活性，进而研究驱动蛋白生化或生理功能。附图说明图1为体内和体外研究驱动蛋白酶活性流程图；图2为GhKCH2MD纯化、结晶、衍射和结构示意图；其中，A为GST亲和纯化后SDS-PAGE鉴定GhKCH2MD蛋白纯度；B为GhKCH2MD凝胶过滤层析(Superdex20010/300GL)的色谱图及SDS-PAGE鉴定蛋白纯度；C为GhKCH2MD在0.1MTris-HCl，pH7.0，15％(w/v)PEG20000，1mMTCEP条件下长出的晶体；D为在上海光源BL17U1线站上获得的晶体衍射图；E为GhKCH2MD整体结构图；图3为GhKCH2结构比对图和序列比对图；其中，A为GhKCH2和经典动蛋白在核苷酸结合口袋处结构比对；B为驱动蛋白核苷酸结合口袋的序列比对；图4为GhKCH2MD各突变体纯化及微管激活的ATPase酶活性测定结果；其中，A为GhKCH2MD各突变体亲和纯化后SDS-PAGE鉴定蛋白纯度；B为GhKCH2MD各突变体ATPase活性测定。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本专利技术保护的范围。需要说明的是，本专利技术的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本专利技术的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。下面结合附图对本专利技术做进一步详细描述：本专利技术公开的体外调控驱动蛋白酶活性流程如图1所示，通过此本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种调控驱动蛋白活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)构建驱动蛋白马达区表达载体，然后进行表达和纯化；/n2)对构建的驱动蛋白马达区结晶和结构解析；/n3)通过对驱动蛋白马达区序列和结构进行比对，获得关键突变位点；/n4)构建点突变质粒，然后分别进行野生型和突变体的表达纯化，根据结果，通过突变上述关键位点调控驱动蛋白酶活性。/n

【技术特征摘要】
1.一种调控驱动蛋白活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建驱动蛋白马达区表达载体，然后进行表达和纯化；
2)对构建的驱动蛋白马达区结晶和结构解析；
3)通过对驱动蛋白马达区序列和结构进行比对，获得关键突变位点；
4)构建点突变质粒，然后分别进行野生型和突变体的表达纯化，根据结果，通过突变上述关键位点调控驱动蛋白酶活性。


2.根据权利要求1所述的调控驱动蛋白活性的方法，其特征在于，通过将关键突变位点突变为不同氨基酸，能够在同一位点增加或降低酶活性。


3.根据权利要求1所述的调控驱动蛋白活性的方法，其特征在于，所述驱动蛋白为棉花驱动蛋白GhKCH2。


4.根据权利要求3所述的调控驱动蛋白活性的方法，其特征在于，构建GhKCH2马达区(GhKCH2motordomain,GhKC...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦兴华，刘国琴，陈子溦，高凤，
申请(专利权)人：西北工业大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61