一种改造钴内稳态减少腈水合酶生产中钴用量的方法技术

本发明专利技术公开了一种改造钴内稳态减少腈水合酶生产中钴用量的方法，属于基因工程和发酵工程技术领域。本发明专利技术所述方法中使用的Co

A method to improve the internal stability of cobalt and reduce the amount of cobalt in the production of nitrile hydratase

【技术实现步骤摘要】
一种改造钴内稳态减少腈水合酶生产中钴用量的方法
本专利技术涉及一种改造钴内稳态减少腈水合酶生产中钴用量的方法，属于基因工程和发酵工程

技术介绍
腈水合酶是一种金属酶，能够催化腈类物质生成酰胺类物质，在工业生产上主要用于丙烯酰胺和烟酰胺的生产。腈水合酶可由其活性中心所含金属离子的不同分为钴型腈水合酶和铁型腈水合酶。目前腈水合酶已经在大肠杆菌中成功高效表达并扩大于工业应用。大肠杆菌生长速度快、易于培养、发酵工艺简单、蛋白表达量高，这些特点使得利用大肠杆菌生产腈水合酶可以显著提高其产量，并降低生产成本。在使用大肠杆菌生产钴型腈水合酶时，常用IPTG作为诱导剂，并添加Co2+作为腈水合酶活性配体。之前已经开发出使用Co2+作为诱导剂的基因表达系统，并将其应用于腈水合酶生产中。在该系统中，Co2+既作为基因表达的诱导剂，又作为金属配体，从而不需要额外添加诱导剂，降低生产成本的同时也简化了生产工艺。但是，钴是一种较为昂贵的金属，也是重要的化工产品如耐热合金、硬质合金、防腐合金、磁性合金和各种钴盐的重要原料。另外，钴也具有一定毒性，泄露到自然界的钴可造成环境污染，具有潜在的生物危害。大肠杆菌通过Co2+的内稳态系统调节细胞内Co2+含量。该系统主要由两部分组成，Co2+的摄取系统和外排系统。大肠杆菌没有特异性摄取Co2+的转运蛋白，而是通过金属离子通用的转运系统对包含Co2+在内的多种金属离子进行摄取。然而，大肠杆菌含有负责Co2+和镍离子外排的转运蛋白RcnA，可以主动排除细胞内多余的Co2+。人工改造金属内稳态系统，可以改变细胞内的金属离子浓度，从而实现一些特定功能。例如，已经有人通过在大肠杆菌中引入钴镍摄取蛋白增加大肠杆菌对环境中Co2+和镍离子的摄取，从而将其开发为净化器以吸附污染水中的Co2+和Ni2+。然而，不过该研究的目的是增强大肠杆菌对污水中Co2+和Ni2+的富集，只提高了大肠杆菌对Co2+和Ni2+的摄取能力，并没有考虑大肠杆菌对Co2+和Ni2+的排出能力。大肠杆菌高效表达腈水合酶的过程中，腈水合酶需要结合被大肠杆菌摄取到胞内的Co2+，才能形成具有活性的酶。而细胞内Co2+浓度直接决定了腈水合酶结合Co2+的能力，从而影响活性腈水合酶最终的产量。因此，提供一种改造大肠杆菌钴内稳态系统的方法，有助于腈水合酶对Co2+的结合，降低生产过程中Co2+的使用量，降低生产成本，减少Co2+对环境的潜在危害。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种重组质粒，是将编码Co2+摄取蛋白NiCoT和Co2+外排蛋白RcnA的基因单独或共同构建至质粒当中，并利用RBS调节NiCoT和/或RcnA的表达强度。在本专利技术的一种实施方式中，所述NiCoT的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述RcnA的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述NiCoT的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述RcnA的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。在本专利技术的一种实施方式中，用核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的RBSstrong调节NiCoT的表达强度，用核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的RBSweak调节RcnA的表达强度。在本专利技术的一种实施方式中，所述质粒是将钴离子响应的阻遏蛋白RcnR、受阻遏蛋白RcnR调控的启动子与pET28a(+)载体连接得到的；所述受阻遏蛋白RcnR调控的启动子是将阻遏蛋白RcnR的操纵序列rcnO连接到启动子Pveg下游构建得到的；编码所述阻遏蛋白RcnR的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，所述操纵序列rcnO的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，所述启动子Pveg的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示。本专利技术的第二个目的是提供表达上述重组质粒的基因工程菌。本专利技术的第三个目的是提供上述重组质粒在腈水合酶生产中的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用是减少腈水合酶生产中钴用量。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用具体是将上述重组质粒转入大肠杆菌，得到重组大肠杆菌，挑取重组大肠杆菌单菌落在LB培养基中200-220rpm，35-39℃培养8-14h；之后按1-5％接种量(V/V)转入LB培养基中200-220rpm，35-39℃培养；加入钴离子诱导剂后，温度降低至20-25℃进行蛋白表达。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述腈水合酶的基因由融合的α/β亚基基因、编码调控蛋白P的基因组成；所述融合的α/β亚基基因的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，所述编码调控蛋白P的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。本专利技术的第四个目的是提供上述重组质粒在环保领域的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术通过将Co2+摄取蛋白NiCoT和Co2+外排蛋白RcnA的基因单独或共同构建至质粒当中，并利用RBS调节两种蛋白的表达强度，建立人工Co2+内稳态系统，并利用该系统调节Co2+诱导型基因表达系统的性能。首先，利用绿色荧光蛋白GFP验证系统性能，发现可以利用人工Co2+内稳态系统实现对Co2+诱导型基因表达系统性能进行调节，使得在相同Co2+添加条件下基因的表达量发生改变；其次，人工Co2+内稳态系统同时可以减少高浓度Co2+对大肠杆菌细胞的伤害，提高发酵过程中的生物量；另外，将人工Co2+内稳态系统应用于腈水合酶的生产中，发现达到最大酶活的Co2+使用量从500μM降低至300μM，在腈水合酶的酶活和产量不变的基础上，可以显著降低Co2+的使用量。因此，在使用人工Co2+内稳态系统表达腈水合酶时，可以减少腈水合酶生产过程中Co2+添加成本的同时，减少对环境造成的潜在污染。附图说明图1：人工Co2+内稳态系统构建示意图。图2：单独引入Co2+摄取系统和外排系统对Co2+诱导型基因表达系统的影响，a：引入Co2+摄取系统对不同Co2+浓度下细胞密度的影响；b：引入Co2+摄取系统对不同Co2+浓度下基因表达的影响；c：引入Co2+外排系统对不同Co2+浓度下细胞密度的影响；d：引入Co2+外排系统对不同Co2+浓度下基因表达的影响。图3：同时引入Co2+摄取和外排系统对Co2+诱导型基因表达系统的影响，a：高表达NiCoT与不同RcnA表达水平组合对细胞密度的影响；b：低表达NiCoT与不同RcnA表达水平组合对细胞密度的影响；c：高表达NiCoT与不同RcnA表达水平组合对基因表达的影响；d：低表达NiCoT与不同RcnA表达水平组合对基因表达的影响。图4：使用人工Co2+内稳态系统表达腈水合酶，a：不同Co2+添加对细胞密度的影响；b：不同Co2+添加对腈水合酶酶活的影响。具体实施方式1、GFP荧光强度的检测方法：样品12000×g离心2min，收集菌体，PBS缓冲液洗3次，用PBS稀释到一定浓度的菌体悬液，取200μL至96孔黑壁透明底本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组质粒，其特征在于，将编码Co

【技术特征摘要】
1.一种重组质粒，其特征在于，将编码Co2+摄取蛋白NiCoT和Co2+外排蛋白RcnA的基因单独或共同构建至质粒当中，并利用RBS调节NiCoT和/或RcnA的表达强度。


2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述NiCoT的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


3.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述RcnA的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


4.根据权利要求1-3任一所述的重组质粒，其特征在于，用核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的RBSstrong调节NiCoT的表达强度，用核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的RBSweak调节RcnA的表达强度。


5.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述质粒是将钴离子响应的阻遏蛋白RcnR、受阻遏蛋白RcnR调控的启动子与pET28a(+)载体连接得到的；所述受阻遏蛋白RcnR调控的启动子是将阻遏蛋白RcnR的操纵序列rcnO连接到启动子P...

【专利技术属性】
技术研发人员：周哲敏，崔文璟，韩来闯，周丽，刘中美，郭军玲，程中一，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32