质粒载体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，尤其涉及质粒载体及其应用。本发明专利技术以滚环复制为基础，通过模块化pC194质粒复制区域，在repH蛋白的作用下进行切口和连接，即可产生目标cssDNA。工作主要包含质粒结构的设计及cssDNA的验证。本发明专利技术利用滚环复制机理，在已经作为工程菌广泛使用的大肠杆菌体内生产合成环状ssDNA。该发明专利技术已成功的证明，在大肠杆菌体内，可以高效快速的产生环状ssDNA,并利用Cas9蛋白在无前间区序列邻近基序(PAM位点)，只有指导RNA(sgRNA)存在的条件下，可以特异性切割单链DNA的性能，将体内产生的环状ssDNA有效的切割为线性ssDNA并用于基因编辑。

Plasmid vector and its application

【技术实现步骤摘要】
质粒载体及其应用
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及质粒载体及其应用。
技术介绍
ssDNA在生物学、纳米技术和生物技术中有十分广泛的应用，例如：DNA折纸技术等，2006年加州理工学院的Rothemund提出了DNA折纸术这一全新的DNA自组装策略，将DNA自组装领域推进到一个新的发展阶段。该方法使用一条长单链DNA作为骨架链，上百条序列不同的短链DNA作为订书钉链。通过碱基互补作用，订书钉链将骨架链折叠成为所设计的各种形状。在DNA折纸术中，所有订书钉链的DNA序列不同，从而使整个纳米结构在空间上具有完全的可寻址性。DNA折纸技术组装得到的结构可以作为模板，引导其他纳米材料、药物小分子、生物大分子等成分的排列，从而获得光学、电磁学等性能可控的纳米元件、药物载体以及纳米机器人等，使DNA折纸术在纳米领域具有非常广泛的应用价值。然而，由于长ssDNA的天然来源稀缺，迫切需要一种可以合成序列可控(用户自定义)、成本低廉、纯度高、可大规模生产的较长ssDNA的技术。根据所需ssDNA的大小、规模和纯度，其生产可能变得异常昂贵或繁重。虽然化学合成的ssDNA已在商业上得到广泛应用，但这种DNA的长度上限在200(nt)核苷酸之内，而且通常需要额外的处理步骤来去除杂质。可以通过一些生物方法以双链DNA(dsDNA)为模板经过酶处理、磁珠吸附、滚环扩增、环介导的等温扩增，聚合酶/外切核酸酶/切口酶(PEN)反应，引物交换反应(PER)级联反应，链置换扩增或不对称PCR方法生产ssDNA。例如，Pound等使用5’端带生物素修饰的引物进行聚合酶链反应(PCR)扩增，然后使用涂有链霉亲和素的磁珠分离出ssDNA。同样是基于PCR的方法，Veneziano等使用不对称PCR方法，通过利用一个高度顺向的Taq聚合酶，以及在PCR体系中添加数量相差较大的两种引物(正反相引物的摩尔数不同)，生产长度出大于15kb的ssDNA。但是这些基于PCR的方法通常受到方案的复杂性、可扩展性、回收单链的纯度和成本较高等方面的限制。在体内方法中，X.Chen等提出了一种策略，他们首先通过Gibsonassembly无缝克隆的方式，将不同来源的特定DNA片段与噬菌体的复制起始位点M13origin以及质粒的复制起点pBR322origin进行拼接，组装成双链环状的重组噬菌粒，然后将此重组噬菌粒转化引入包含F因子的大肠杆菌，通过大肠杆菌的繁殖进行大量扩增。经辅助噬菌体侵染后，重组噬菌粒以单链的形式包裹于噬菌体并被分泌到培养液中，经历一系列收集纯化操作后，便可获得相应序列的环状单链DNA。通过该方法，他们制备了4种不同长度的单链DNA序列，包括长度分别为30000多和20000多及另外两种不同序列的、长度为10000多个碱基的单链环状DNA。体内的方法(基于M13噬菌体的方法)在噬菌体内产生ssDNA的主要缺点是，其产生的ssDNA的序列被限制在噬菌体内稳定繁殖的基因组的序列上，ssDNA序列不可控即不能生产用户自定义的ssDNA，并且产生的链通常包含大量的载体DNA。并且，由于噬菌体具有转染的特性，它会污染其他试剂，为实验室其他成员的实验带来风险，这大大提升了操作的复杂性。因此，迫切需要成本低廉、纯度高、可大规模安全的生产较长ssDNA的技术。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供质粒载体及其应用，该质粒可以在细菌体内生产环状单链DNA(cssDNA)，引入表达cas9蛋白的载体，则可产生线性ssDNA。而此线性ssDNA可用于基因编辑。本专利技术提供了一种质粒载体，依次包括：单链DNA复制起始位点、单链DNA复制终止位点和RepH表达盒。利用上述质粒载体，可以在表达解旋酶的细胞内生产环状单链DNA(cssDNA)。该质粒以滚环扩增为基础，其原理如图1，具体而言，RepH蛋白特异性地结合到单链DNA复制起始位点上，由于RepH蛋白的挤压，会导致质粒DNA急剧弯曲形成发夹结构，进而促发RepH蛋白在位点(G-A)进行切割，形成切口(nick)位点。此时RepH蛋白并没有脱落，而是通过其活性位点上的酪氨酸残基与5’磷酸共价连接，同时通过特定的蛋白间相互作用招募解旋酶。解旋酶解开dsDNA，直到复制到达单链DNA复制终止位点，repH蛋白另一个活性单体在单链DNA终止区域的一系列切割/重新连接的作用之后，这个环状的ssDNA释放。在解旋酶解开dsDNA后，ssDNA开始产生，为了防治ssDNA降解，可以在表达载体中添加SSB蛋白。这是一种ssDNA结合蛋白，其能够包裹在移位的ssDNA上，以阻止ssDNA降解。一些实施例中，本专利技术所述的质粒载体中还包括SSB表达盒。本专利技术所述的质粒载体中，所述单链DNA复制起始位点、单链DNA复制终止位点之间还包括制备的目的片段。本专利技术方案对制备的目的片段的长度和核苷酸序列没有特殊要求，本专利技术实施例中，对长度为2kbp的DNA片段进行制备cssDNA的验证，结果表明能够成功制备cssDNA。一般而言，革兰氏阴性菌较革兰氏阳性菌的代谢更简单，且细胞壁较薄更有利于转化、提取等操作的进行。故而本专利技术所述cssDNA或ssDNA的制备优选在革兰氏阴性菌种进行。因此，本专利技术所述的质粒载体中还包括革兰氏阴性菌的复制起始区。本专利技术中，所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌。经验证，相对于采用中低拷贝数的质粒(例如pet19b)，以高拷贝数质粒作为骨架载体更有利于制备过程的进行。一些具体实施例中，用于制备cssDNA的所述质粒载体的骨架载体为pUC19载体。在以大肠杆菌为重组宿主制备cssDNA的实施例中，编码所述SSB蛋白的核酸序列来自大肠杆菌，其GenBankSequenceID为CP032667.1。该实施例中，编码所述RepH蛋白的核酸序列来自大肠杆菌，其GenBankSequenceID为V01277.1。在该实施例中，所述革兰氏阴性菌的复制起始区为ColE1，其来自pUC19质粒。为了更好的进行筛选和标记，本专利技术所述的质粒载体中还包括抗性筛选标记。一些实施例中，所述抗性筛选标记为Amp标记，所述Amp抗性标记的核酸序列来自pUC19质粒。在该实施例中，所述质粒载体中各元件的连接顺序为ColE1区域、Amp抗性标记、单链DNA复制起始位点、制备目的片段、单链DNA复制终止位点、repH表达盒、SSB表达盒。为了在不含有解旋酶的细胞体内也能够实现cssDNA的制备，本专利技术所述的质粒载体上还包含解旋酶的表达盒。所述编码所述解旋酶的DNA序列来自大肠杆菌，具体为UvrD解旋酶。上述质粒载体中，单链DNA复制起始位点、单链DNA复制终止位点之间的片段即为复制产生cssDNA的模板片段。该片段与质粒上的其他区域一样都是双链，其获取可采用现有技术中已知的任何方法进行，本专利技术实施例中采用PCR的方法对目的片段进行制备。即通过PCR的方式制备与cssDNA序列一致的双链DNA，其中一条链与需制备的cssDNA一致，另一条链与cssDNA反向本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种质粒载体，依次包括：单链DNA复制起始位点、单链DNA复制终止位点和RepH表达盒。/n

【技术特征摘要】
1.一种质粒载体，依次包括：单链DNA复制起始位点、单链DNA复制终止位点和RepH表达盒。


2.根据权利要求1所述的质粒载体，其特征在于，还包括SSB表达盒。


3.根据权利要求1或2所述的质粒载体，其特征在于，所述单链DNA复制起始位点、单链DNA复制终止位点之间还包括制备的目的片段。


4.根据权利要求1或2所述的质粒载体，其特征在于，依次包括：单链DNA复制起始位点、cas9识别位点1、cas9识别位点2、单链DNA复制终止位点、RepH表达盒和gRNA元件。


5.根据权利要求4所述的质粒载体，其特征在于，所述cas9识别位点1与cas9识别位点2之间还包括制备的目的片段。


6.根据权利要求4所述的质粒载体，其特征在于，所述cas9识别位点1与cas9识别位点2之间还包括基因编辑目的片段；所述基因编辑的目的片段包括靶基因的左同源臂、donor片段和右同源臂。


7.根据权利要求1～6任一项所述的质粒载体，其特征在于，还包括革兰氏阴性菌的复制起始区。


8.根据权利要求1～7任一项所述的质粒载体，其特征在于，所述单链DNA复制起始位点的序列如SEQIDNO:1所示，所述单链DNA复制终止位点的序列如SEQIDNO:2或3所示。


9.根据权利要求1～8任一项所述的质粒载体，其特征在于，还包括解旋酶表达盒。


10.权利要求1～3或7～9任一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐浩，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12