p53信使RNA纳米粒及其制备方法和在制备治疗肿瘤药物中的应用技术

本发明专利技术p53信使RNA纳米粒及其制备方法和在制备治疗肿瘤药物中的应用，属于基因工程技术领域。p53信使RNA纳米粒通过下述方法制备：1、体外合成化学修饰的p53mRNA，2、自组装方法制备纳米体系进行体内递送p53信使RNA。p53信使RNA纳米粒通过恢复p53抑癌功能发挥抗肿瘤及增强化疗敏感性治疗作用。本发明专利技术的优点：1.本发明专利技术中p53信使RNA成功通过纳米体系递送至p53失活的肝癌和肺癌肿瘤细胞内，在体内外高效快速地诱导细胞凋亡和G1期细胞周期阻滞从而显著抑制了肿瘤细胞的生长；2.纳米粒递送的p53信使RNA可通过回补肿瘤内缺失的抑癌因子p53来增强mTOR抑制剂依维莫司的抗肿瘤作用。

P53 messenger RNA nanoparticles and their preparation and application in the preparation of tumor drugs

【技术实现步骤摘要】
p53信使RNA纳米粒及其制备方法和在制备治疗肿瘤药物中的应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及p53信使RNA纳米粒及其制备方法和在制备治疗肿瘤药物中的应用

技术介绍
癌症的发生发展除了肿瘤抑制因子的失活外，还伴有促肿瘤生长功能通路的异常激活，如哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)，一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可促进细胞的生长和增殖。mTOR信号通路在60％的肿瘤中异常激活从而增加肿瘤细胞的增殖能力，包括肝癌和肺癌。依维莫司(RAD001)是一种典型的mTOR抑制剂，已被FDA临床批准用于晚期肾癌、胰腺神经内分泌肿瘤及其他类型的癌症。然而，依维莫司并不能有效提高肝细胞肝癌(HCC)及非小细胞肺癌(NSCLC)患者的生存率。研究显示依维莫司的临床治疗差异性主要取决于不同肿瘤细胞存在的耐药机制，包括i)保护性自噬的激活；ii)凋亡通路的失调(如，抗凋亡蛋白Bcl-2的上调)。从而依维莫司与自噬抑制剂或Bcl-2抑制剂联合使用可以提高抗肿瘤的疗效，然而这些抑制剂也可以通过干扰正常细胞的生理功能诱导不可避免的毒副作用。肿瘤患者中p53是突变频率最高的一个基因,根据癌症基因组图谱(TCGA)数据库统计(http://cbioportal.org)，36％的肝细胞肝癌和68％的非小细胞肺癌中检测到p53基因低表达。p53抑癌基因参与调节多重细胞通路，作为转录因子，p53可以激活其下游基因，如促凋亡蛋白Bax(Bcl-2相关蛋白)和PUMA(p52上调凋亡调节因子)从而抵抗致癌信号的促增殖作用。作为细胞周期检查点，p53可以诱导细胞周期停滞，参与DNA复制和修复过程，保护基因组完整性。此外，细胞质p53还可以抑制引起化疗耐药的保护性自噬的激活。对于p53基因功能的恢复，目前有两种策略：i)使用小分子抑制剂阻断MDM2对p53的拮抗作用，从而释放p53或使其突变体的功能重新活化；ii)通过病毒或非病毒载体进行DNA转染恢复功能性拷贝。尽管这些尝试都取得了一些成功，但两种方法都存在很大的应用局限性，例如，对于p53抑癌基因发生缺失突变时，小分子抑制剂将无效果；基于p53的DNA基因疗法存在基因组整合以及导致基因组突变的潜在风险。
技术实现思路
近几年，信使RNA(mRNA)由于其独特的优势(例如，不存在基因组整合、直接和快速的蛋白质表达等)引起了研究人员的广泛关注。利用肿瘤抑制基因mRNA治疗肿瘤是直接和非常有希望的一种策略，但是如何高效递送mRNA到肿瘤部位仍然是一个难点及挑战，因此目前为止还没有关于使用信使RNA修复p53抑癌基因功能的报道。因此我们设计了针对p53的信使RNA(mRNA)通过肿瘤靶向的纳米体系递送p53mRNA至肝细胞肝癌和非小细胞肺癌中进行p53功能的恢复，结果表明，p53mRNA成功通过纳米体系递送至p53失活的肝细胞肝癌(Hep3B)及非小细胞肺癌细胞(H1299)，并高效快速地诱导细胞凋亡和G1期细胞周期阻滞从而显著抑制了肿瘤细胞的生长。与此同时，p53mRNA纳米系统可通过p53功能介导的抑制保护性自噬和诱导凋亡通路双重作用加强p53缺陷的肿瘤细胞对依维莫司的化疗敏感性，从而在体内和体外实验中产生协同抗肿瘤效果。本专利技术的目的在于公开了p53信使RNA纳米粒。本专利技术第二个目的在于公开了上述p53信使RNA纳米粒的制备方法。本专利技术第三个目的在于公开了上述p53信使RNA纳米粒在制备治疗肿瘤药物中的应用。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种p53信使RNA纳米粒，所述p53信使RNA纳米粒是通过下述方法制备：(1)、用HindIII/ApaI核酸内切酶消化携带T7启动子的人p53基因开放阅读框质粒形成线性化DNA，然后，PCR扩增含有T7启动子的p53开放阅读框，并对PCR产物进行纯化；对于体外转录(IVT)，将转录试剂盒与1-2μg作为模板的纯化的聚合酶链式反应产物、6mM3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G帽结构类似物、1.5mM三磷酸鸟苷、7.5mM5-甲基-胞苷三磷酸、7.5mM三磷酸腺苷和7.5mM假尿苷-5’-三磷酸一起使用，反应在37℃下进行4小时，随后进行脱氧核糖核酸酶(DNase)处理；随后，使用poly(A)试剂盒将3’poly(A)试剂盒添加到IVTRNA转录物中；得到p53信使RNA；p53信使RNA经MEGAclear试剂盒纯化后用热敏磷酸酶在37℃下处理30分钟，随后进一步纯化得到所需mRNA产物；(2)、将G0-C14、二硫酰胺和脂质乙二醇分别溶解于有机溶剂中，分别形成浓度为2.5mg/ml、20mg/ml和20mg/ml的均匀溶液；在G0-C14/p53信使RNA重量比为15的条件下，将p53信使RNA和G0-C14轻轻混合，以实现静电络合；随后，将200μl有机溶剂中的4mg二硫酰胺聚合物和140μl有机溶剂中的2.8mg混合脂质乙二醇依次添加到p53信使RNA和G0-C14的混合物中，并进一步混合在一起，形成最终混合物；在800转/分的磁力搅拌下将最终混合物逐滴添加到10毫升不含DNase/RNase的胎牛血清超纯水中30分钟，其中超纯水为分子生物学级；使用超滤装置(EMDMillipore，MWCO100kDa)通过离心去除形成的纳米粒分散液中的有机溶剂和游离化合物；用高压水洗涤3次后，将p53信使RNA纳米粒收集并分散于pH7.4-PBS缓冲液中以供进一步使用或储存于-80℃冰箱。上述技术方案中p53信使RNA纳米粒的制备方法，其中，所述制备方法包括下述步骤：(1)、用HindIII/ApaI核酸内切酶消化携带T7启动子的人p53基因开放阅读框质粒形成线性化DNA，然后，PCR扩增含有T7启动子的p53开放阅读框，并对PCR产物进行纯化；对于体外转录(IVT)，将转录试剂盒与1-2μg作为模板的纯化的聚合酶链式反应产物、6mM3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G帽结构类似物、1.5mM三磷酸鸟苷、7.5mM5-甲基-胞苷三磷酸、7.5mM三磷酸腺苷和7.5mM假尿苷-5’-三磷酸一起使用，反应在37℃下进行4小时，随后进行脱氧核糖核酸酶(DNase)处理；随后，使用poly(A)试剂盒将3’poly(A)试剂盒添加到IVTRNA转录物中；p53信使RNA经MEGAclear试剂盒纯化后用热敏磷酸酶在37℃下处理30分钟，随后进一步纯化得到所需mRNA产物；(2)、将G0-C14、二硫酰胺和脂质乙二醇分别溶解于有机溶剂中，分别形成浓度为2.5mg/ml、20mg/ml和20mg/ml的均匀溶液；在G0-C14/p53信使RNA重量比为15的条件下，将p53信使RNA和G0-C14轻轻混合，以实现静电络合；随后，将200μl有机溶剂中的4mg二硫酰胺聚合物和140μl有机溶剂中的2.8mg混合脂质乙二醇依次添加到p53信使RNA和G0-C14的混合物中，并本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种p53信使RNA纳米粒，所述p53信使RNA纳米粒是通过下述方法制备：/n(1)、用HindIII/ApaI核酸内切酶消化携带T7启动子的人p53基因开放阅读框质粒形成线性化DNA，然后，PCR扩增含有T7启动子的p53开放阅读框，并对PCR产物进行纯化；/n对于体外转录，将

【技术特征摘要】
1.一种p53信使RNA纳米粒，所述p53信使RNA纳米粒是通过下述方法制备：
(1)、用HindIII/ApaI核酸内切酶消化携带T7启动子的人p53基因开放阅读框质粒形成线性化DNA，然后，PCR扩增含有T7启动子的p53开放阅读框，并对PCR产物进行纯化；
对于体外转录，将T7转录试剂盒与1-2μg作为模板的纯化的聚合酶链式反应产物、6mM3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G帽结构类似物、1.5mM三磷酸鸟苷、7.5mM5-甲基-胞苷三磷酸、7.5mM三磷酸腺苷和7.5mM假尿苷-5’-三磷酸一起使用，反应在37℃下进行4小时，随后进行脱氧核糖核酸酶处理；随后，使用poly(A)试剂盒将3’poly(A)试剂盒添加到IVTRNA转录物中；得到p53信使RNA；
p53信使RNA经MEGAclear试剂盒纯化后用热敏磷酸酶在37℃下处理30分钟，随后进一步纯化得到所需mRNA产物；
(2)、将G0-C14、二硫酰胺和脂质乙二醇分别溶解于有机溶剂中，分别形成浓度为2.5mg/ml、20mg/ml和20mg/ml的均匀溶液；
在G0-C14/p53信使RNA重量比为15的条件下，将p53信使RNA和G0-C14轻轻混合，以实现静电络合；
随后，将200μl有机溶剂中的4mg二硫酰胺聚合物和140μl有机溶剂中的2.8mg混合脂质乙二醇依次添加到p53信使RNA和G0-C14的混合物中，并进一步混合在一起，形成最终混合物；
在800转/分的磁力搅拌下将最终混合物逐滴添加到10毫升不含DNase/RNase的胎牛血清超纯水中30分钟，其中超纯水为分子生物学级；
使用EMDMillipore的MWCO100kDa超滤装置通过离心去除形成的纳米粒分散液中的有机溶剂和游离化合物；用高压水洗涤3次后，将p53信使RNA纳米粒收集并分散于pH7.4-PBS缓冲液中以供进一步使用或储存于-80℃冰箱。


2.上述p53信使RNA纳米粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括下述步骤：
(1)、用HindIII/ApaI核酸内切酶消化携带T7启动子的人p53基因开放阅读框质粒形成线性化DNA，然后，PCR扩增含有T7启动子的p53开放阅读框，并对PCR产物进行纯化；
对于体外转录，将T...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔娜，谢恬，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33