本发明专利技术公开了一种转基因抗虫耐除草剂玉米BBHTL8‑1外源插入片段旁侧序列及其应用。所述旁侧序列的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术还提供了用于检测3’端旁侧序列的引物对。本发明专利技术的转基因抗虫耐除草剂品质改良玉米BBHTL8‑1外源插入片段旁侧序列的鉴定适用于玉米BBHTL8‑1包括亲本、杂交种以及后代相关材料，包括植株、组织、种子及相关制品的检测。
The flanking sequence and its application of exogenous insertion fragment of transgenic maize bbhtl8-1
【技术实现步骤摘要】
转基因玉米BBHTL8-1外源插入片段旁侧序列及其应用
本专利技术属于植物生物
，具体涉及一种转基因抗虫耐除草剂玉米BBHTL8-1外源插入片段旁侧序列及其应用。
技术介绍
玉米在我国重要的粮食作物，也是重要的饲料及工业原料，在保障国家粮食安全和国民经济发展中发挥重要作用。玉米螟和双斑萤叶甲每年都对我国的玉米生产造成重大损失。杂草也对我国玉米生产造成严重危害，一般年份造成10-30%的减产，严重可达50%以上，随着人工成本的增加，依靠人工除草大大增加生产成本。为防治害虫和降低杂草发生，农民常大量使用高毒化学农药进行防治，导致玉米农药残留严重，且喷药过程容易引起中毒事件发生，严重危害人民健康。抗虫和抗除草剂玉米的研制对于我国玉米产业的发展具有重要意义。转基因技术为玉米的遗传改良提供了一条新的分子育种途径。利用转基因技术培育的抗虫、抗除草剂转基因作物是农业害虫控制和杂草防除的有效手段，可有效减少农民对化学杀虫剂的依赖，降低人工成本，提高玉米产量和品质，对于保护生态环境和生物多样性具有重要意义。Bt基因Cry1Ab主要应用于针对鳞翅目害虫玉米螟和棉铃虫的抗虫基因。孟山都公司的MON810、杜邦公司的TC1507、先正达公司的Bt11、Bt176、先锋公司的DP4114等转基因品种含有Cry1Ab，均已实现了商业化种植推广。Cry3Bb主要针对玉米双斑萤叶甲等鞘翅目类昆虫，孟山都公司的MON863、MON88017中的Cry3Bb1可以抗玉米根虫鞘翅目害虫。草甘膦（Glyphosate）是一种内吸性、广谱性、施用于叶面的有机膦类除草剂，1971年由孟山都公司成功开发，是全球销售最好的除草剂，具有高效、低毒、易降解等特点。其可以竞争性抑制植物和细菌的莽草酸途径中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性。孟山都公司的NK603、MON87427将具有抗草甘膦除草剂能力的cp4epsps基因转入农作物中，使这些作物具有抗草甘膦能力，并得到了大规模的商业化应用。维生素E（生育酚）具有重要的抗氧化功能，是动物和人体必须的一种脂溶性维生素，包括8种生育酚，即α、β、γ、δ-生育酚和α、β、γ、δ-三烯生育酚，玉米中以α、β、γ、δ-生育酚为主，其中α-生育酚活性最高，γ-生育酚在玉米中含量最高，但其活性只有α-生育酚的1/10。ZmHPT可以提高植物体内的维生素E总含量。ZmTMT可以把低活性的γ-生育酚转化为高活性的α-生育酚，两个基因的结合可以显著提高玉米的α-生育酚含量。国际农业生物技术应用服务组织发布的2018年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势表明，2018年转基因作物继续保持高应用率，全球种植面积达到1.917亿公顷。具有复合抗虫性状的转基因作物种植面积占全球种植面积的42%。在美国，复合性状的转基因玉米的种植面积占玉米总种植面积的76%。复合性状转基因作物具有成本低、效率高、管理方便、投入较少等优点，将会得到农民的更多的应用和青睐。转基因作物抗虫的关键是获得具有抗虫性能的优良杀虫蛋白，目前比较常用的是BT杀虫蛋白，比如Cry1Ab、Cry1F、Cry2Bb等。单独使用一种杀虫蛋白容易引起害虫的抗性产生和发展。培育含多个抗虫蛋白的转基因作物可以更有效地延缓害虫抗性的发生，种植具有复合性状的转基因作物已成为趋势。除了抗虫耐除草剂性状外，转基因植物也引入其它优良性状，比如防褐变、低丙烯酰胺含量、抗晚疫病等性状的马铃薯、防褐变的苹果、耐旱甘蔗、含有维生素A原转化体GR2E的转基因黄金大米等。我国还没有商业化种植的转基因玉米，转基因玉米研发处于环境安全评价的不同阶段，我们培育的转基因玉米具有抗虫耐除草剂和富含维生素E复合性状特性，籽粒中的维生素E的含量提高，能够满足饲料需求，可降低饲料生产成本，同时降低化学合成造成的污染。未来通过转基因安全评价获得安全生产证书后，可应用于商业种植，有效的减少玉米螟发生、降低杂草发生，降低人工成本和农药使用，提高玉米生产效益。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种转基因抗虫耐除草剂玉米BBHTL8-1外源插入片段旁侧序列及其应用。一种转基因玉米BBHTL8-1外源插入旁侧序列，所述旁侧序列的核苷酸序列分别如序列表SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。所述外源插入片段包括抗虫基因Cry1Ab、Cry3Bb、抗草甘膦基因cp4epsps基因、玉米ZmHPT和ZmTMT基因。所述转基因玉米BBHTL8-1外源插入序列及其旁侧序列在检测转基因玉米BBHTL8-1中的应用。用于检测转基因玉米BBHTL8-1的特异性引物对，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：3-4所示。用于检测转基因玉米BBHTL8-1的试剂盒，含有所述的特异性引物对。所述的特异性引物对在检测转基因玉米BBHTL8-1亲本、后代、杂种F1，及其植株、组织、种子或其制品中的应用。一种检测转基因玉米BBHTL8-1的方法，以样品总DNA为模板，利用所述的特异性引物对进行PCR反应，若扩增产物条带大小为240bp，则待测样品含有BBHTL8-1来源的成分。本专利技术的有益效果：本专利技术根据玉米的密码子使用频率对抗虫基因Cry1Ab、Cry3Bb和抗草甘膦基因cp4epsps基因密码子进行优化，使其在玉米中能够高效表达和翻译，将优化的Cry1Ab、Cry3Bb和cp4epsps以及来自玉米的ZmHPT和ZmTMT基因构建到植物表达载体，采用农杆菌侵染法，转化幼胚，以草甘膦为选择压力，获得了具有抗虫、耐除草剂复合抗性的转基因玉米。利用全基因组测序和旁侧序列测序对外源片段插入位置进行了分析，对Cry1Ab、Cry3Bb、cp4epsps、ZmHPT和ZmTMT基因表达量和蛋白表达量进行了分析，同时对转基因玉米的抗虫和除草剂性能、籽粒维生素E含量进行了评价。BBHTL8-1转基因玉米今后有可能进入商业化种植。本专利技术提供了抗虫耐除草剂转基因玉米BBHTL8-1插入位点的外源插入片段的旁侧序列，其为外源插入片段的3’端旁侧序列。特定的转基因事件其旁侧序列是特定的，旁侧序列与外源基因组的整合片段，可以通过设计引物，包含至少部分旁侧序列和至少部分外源插入片段，进行PCR扩增，检测特异性PCR条带。在外源插入片段设计上游特异性引物，在3’旁侧序列设计下游特异引物，扩增特异性片段。也可以根据在5’端旁侧序列设计上游特异性引物，根据外源插入片段设计下游特异性引物，扩增特异性片段。附图说明图1为pL8质粒的图谱。图2为Cry1Ab、Cry3Bb、ZmTMT、ZmHPT、cp4epsps基因在BBHTL8-1材料特异性PCR检测；图中，阴性对照为郑58，阳性对照为转基因T1代植株，Marker为100bp分子量标准。图3BBHTL8-1材料特异性PCR检测；图中，1：BBHTL8-1玉米株系；2：阳性对照（转基因T1代植株）；3：阴性对照（非转基因郑58对照）；M：100bp分子量标准。图4为Cry1Ab、Cry3B本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种转基因玉米BBHTL8-1外源插入旁侧序列，其特征在于，所述旁侧序列的的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种转基因玉米BBHTL8-1外源插入旁侧序列，其特征在于，所述旁侧序列的的核苷酸序列分别如序列表SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。
2.根据权利要求1所述转基因玉米BBHTL8-1外源插入旁侧序列，其特征在于，所述外源插入片段包括抗虫基因Cry1Ab、Cry3Bb、抗草甘膦基因cp4epsps基因、玉米ZmHPT和ZmTMT基因。
3.权利要求1或2所述转基因玉米BBHTL8-1外源插入序列及其旁侧序列在检测转基因玉米BBHTL8-1中的应用。
4.用于检测转基因玉米BBHTL8-1...
【专利技术属性】
技术研发人员：王磊，邹俊杰，张兰，徐妙云，郑红艳，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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