转基因玉米BFL4-2外源插入片段旁侧序列及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种转基因抗虫耐除草剂玉米BFL4‑2外源插入片段旁侧序列及其应用。所述旁侧序列的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术提供了用于检测3’端旁侧序列的引物对。本发明专利技术的转基因抗虫耐除草剂玉米BFL4‑2外源插入片段旁侧序列的鉴定适用于玉米BFL4‑2包括亲本、杂交种以及后代相关材料，包括植株、组织、种子及相关制品的检测。

Flanking sequence of bfl4-2 foreign insertion fragment of transgenic maize and its application

【技术实现步骤摘要】
转基因玉米BFL4-2外源插入片段旁侧序列及其应用
本专利技术属于植物生物
，具体涉及一种转基因抗虫耐除草剂玉米BFL4-2外源插入片段旁侧序列及其应用。
技术介绍
玉米是我国第一大粮食作物，也是重要的饲料及工业原料，在国家粮食安全和国民经济发展中占有非常重要地位。然而在玉米生长发育过程中，常遭受病害、虫害、草害的影响。玉米螟俗称钻心虫，是造成玉米常年减产的重要生物灾害之一，每年造成玉米产量的重大损失。其危害造成的伤口又是玉米穗腐病病原菌入侵的途径，害虫本身常携带病原菌，从而诱发和加重玉米穗腐病的发生。农民常大量使用高毒化学农药进行防治，导致玉米农药残留严重，且农药中毒事件也频频发生，严重危害人民健康。田间杂草与作物争夺养分、水分和光源，严重影响作物的生长发育，造成严重减产，一般年份造成10-30%的减产，严重可达50%以上，随着人工成本的增加，依靠人工除草大大增加生产成本。转基因技术为玉米的遗传改良提供了一条新的分子育种途径。利用转基因技术培育的抗虫、抗除草剂转基因作物是农业害虫控制和杂草防除的有效手段，可有效减少农民对化学杀虫剂的依赖，降低人工成本，提高玉米产量和品质，对于保护生态环境和生物多样性具有重要意义。Bt基因Cry1Ab、Cry1F主要应用于针对鳞翅目害虫玉米螟和棉铃虫的抗虫基因。孟山都公司的MON810、杜邦公司的TC1507、先正达公司的Bt11、Bt176、先锋公司的DP4114等均已实现了商业化种植推广。草甘膦（Glyphosate）是一种内吸性、广谱性、施用于叶面的有机膦类除草剂，1971年由孟山都公司成功开发，是全球销售最好的除草剂，具有高效、低毒、易降解等特点。其可以竞争性抑制植物和细菌的莽草酸途径中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）的活性。孟山都公司的NK603、MON87427将具有抗草甘膦除草剂能力的cp4epsps基因转入农作物中，使这些作物具有抗草甘膦能力，并得到了大规模的商业化应用。国际农业生物技术应用服务组织发布的2018年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势表明，2018年转基因作物继续保持高应用率，全球种植面积达到1.917亿公顷。具有复合抗虫性状的转基因作物种植面积占全球种植面积的42%。在美国，复合性状的转基因玉米的种植面积占玉米总种植面积的76%。复合性状转基因作物具有成本低、效率高、管理方便、投入较少等优点，将会得到农民的更多的应用和青睐。转基因作物抗虫的关键是获得具有抗虫性能的优良杀虫蛋白，目前比较常用的是BT杀虫蛋白，比如Cry1Ab、Cry1F、Cry2Bb等。单独使用一种杀虫蛋白容易引起害虫的抗性产生和发展。培育含多个抗虫蛋白的转基因作物可以更有效地延缓害虫抗性的发生，种植具有复合性状的转基因作物已成为趋势。我国还没有商业化种植的转基因玉米，转基因玉米研发处于环境安全评价的不同阶段，培育的转基因玉米具有抗虫耐除草剂复合性状特性，未来通过转基因安全评价获得安全生产证书后，可应用于商业种植，有效的减少玉米螟发生、提高除草效率，降低人工成本和农药使用，提高玉米生产效益。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种转基因抗虫耐除草剂玉米BFL4-2外源插入片段旁侧序列及其应用。一种转基因玉米BFL4-2外源插入旁侧序列，所述旁侧序列的核苷酸序列分别如序列表SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。所述外源插入片段包括Cry1Ab、Cry1F和cp4epsps基因。所述转基因玉米BFL4-2外源插入序列及其旁侧序列在检测转基因玉米BFL4-2中的应用。用于扩增所述的DNA片段的特异性引物对。用于检测转基因玉米BFL4-2的特异性引物对，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：3-4所示。用于检测转基因玉米BFL4-2的试剂盒，含有所述的特异性引物对。所述的特异性引物对在检测转基因玉米BFL4-2亲本、后代、杂种F1，及其植株、组织、种子或其制品中的应用。一种检测转基因玉米BFL4-2的方法，以样品总DNA为模板，利用所述的特异性引物对进行PCR反应，若扩增产物条带大小为296bp，则待测样品含有BFL4-2来源的成分。本专利技术的有益效果：本专利技术根据玉米的密码子使用频率对抗虫基因Cry1Ab、Cry1F和抗草甘膦基因cp4epsps基因密码子进行优化，使其在玉米中能够高效表达和翻译，将Cry1Ab、Cry1F和cp4epsps基因串联表达，转入玉米，获得具有抗虫、耐除草剂复合抗性的转基因玉米。利用全基因组测序和旁侧序列测序对外源片段插入位置进行了分析，对Cry1Ab、Cry1F、cp4epsps基因表达量和蛋白表达量进行了分析，同时对转基因玉米的抗虫和除草剂性能进行了评价。本专利技术提供了抗虫耐除草剂转基因玉米BFL4-2插入位点的外源插入片段的旁侧序列，包括外源插入片段的3’端旁侧序列和5’端旁侧序列。特定的转基因事件其旁侧序列是特定的，旁侧序列与外源基因组的整合片段，可以通过设计引物，包含至少部分旁侧序列和至少部分外源插入片段，进行PCR扩增，检测特异性PCR条带。在外源插入片段设计上游特异性引物，在3’旁侧序列设计下游特异引物，扩增特异性片段。也可以根据在5’端旁侧序列设计上游特异性引物，根据外源插入片段设计下游特异性引物，扩增特异性片段。附图说明图1为pL4质粒的图谱。图2为Cry1Ab、Cry1F、cp4epsps基因在BFL4-2的3代材料中的PCR检测；图中，阴性对照为郑58，阳性对照为转基因T1代植株，Marker为100bp分子量标准。图3为BFL4-2材料特异性PCR检测；图中，1：BFL4-2玉米株系；2：阳性对照（转基因T1代植株）；3：阴性对照（非转基因郑58对照）；M：100bp分子量标准。图4为Cry1Ab、Cry1F、cp4epsps基因在BFL4-2材料5叶期和成熟期表达量；图中，A为Cry1Ab、Cry1F、cp4epsps基因在BFL4-2材料5叶期表达量；B为Cry1Ab、Cry1F、cp4epsps基因在BFL4-2材料成熟期表达量。图5为BFL4-2材料抗除草剂和抗虫性能评价；图中，A为喷施草甘膦1周后转基因BFL4-2材料与非转基因对照材料生长情况；B和C为田间接虫后非转基因植株和BFL4-2在叶片B和果穗C上的表型；白色箭头所指为虫孔位置；对照为非转基因玉米材料郑58。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。实施例1转基因材料的获得根据玉米的密码子使用频率对cp4epsps、cry1Ab和cry1F基因进行密码子优化，将优化的cp4epsps、cry1Ab和cry1F基因构建到植物表达载体，载体骨架来自pCAMBIA1300载体序列，构建好本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转基因玉米BFL4-2外源插入旁侧序列，其特征在于，所述旁侧序列的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种转基因玉米BFL4-2外源插入旁侧序列，其特征在于，所述旁侧序列的核苷酸序列分别如序列表SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。


2.根据权利要求1所述转基因玉米BFL4-2外源插入旁侧序列，其特征在于，所述外源插入片段包括Cry1Ab、Cry1F和cp4epsps基因。


3.权利要求1或2所述转基因玉米BFL4-2外源插入序列及其旁侧序列在检测转基因玉米BFL4-2中的应用。


4.用于检测转基因玉米BFL4-2的特异性引物对，其特征在于，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：王磊，邹俊杰，徐妙云，张兰，郑红艳，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11