CAS转基因小鼠胚胎干细胞和小鼠及其应用制造技术

本文提供用于评价CRISPR/Cas介导的非同源末端连接的活性和/或CRISPR/Cas诱导的目标基因组基因座与外源供体核酸的体内或离体重组的方法和组合物。所述方法和组合物使用包含诸如基因组整合的Cas表达盒之类的Cas表达盒的细胞和非人类动物，从而使得Cas蛋白质组成上可获取的或以组织特异性或时间特异性的方式可获取。本文还提供用于产生和使用这些非人类动物的方法和组合物，包括使用这些非人类动物通过腺相关病毒(AAV)介导的将向导RNA递送至所述非人类动物来评价CRISPR/Cas的体内活性。

CAS transgenic mouse embryonic stem cells and mice and their application

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】CAS转基因小鼠胚胎干细胞和小鼠及其应用相关申请的交叉引用本申请要求2017年7月31日提交的美国申请US62/539,275的权益，该美国申请的全部内容通过引用并入本文，用于所有目的。对通过EFSWEB以TEXT文件格式提交的序列表的引用在文件516569SEQLIST.txt中写入的序列表的大小为178千字节，其于2018年7月30日创建，并通过引用并入本文。
技术介绍
CRISPR/Cas技术有望成为一种新的治疗形式。然而，目前需要更好的通过引入体内的CRISPR/Cas试剂评价突变产生效率或目标基因突变效率的方式。在体内对系统进行测试的一个限制在于需要将所有成分同时引入活体生物体中。引入这些成分的经典方法是将DNA构建体瞬时转染至将会产生合适的RNA和蛋白质的细胞中。虽然这种方法很有效，但是这种方法具有固有缺点，这是因为细胞必须依赖于质粒DNA构建体，从而先经历转录再进行翻译，随后Cas9蛋白质能够与sgRNA成分发生相互作用。因此，需要更好的方法和工具来更加有效地评价引入的CRISPR/Cas试剂的活性并且评价靶定体内特定组织或细胞类型的不同的递送方法和参数。此外，诸如CRISPR/Cas试剂之类的生物活性试剂向受治者的递送通常由于各个成分难以到达目标细胞或组织而受到限制。这些限制可能会导致例如，需要使用比实现期理想结果高得多的浓度的试剂，这会增加毒副作用的风险。因此，本领域需要改进的递送方法以及体内评价这种递送方法的方法。
技术实现思路
本文提供Cas9就绪(Cas9-ready)的非人类动物，并且本文提供用于评价CRISPR/Cas核酸酶试剂体内修饰目标基因组基因座的能力的方法和组合物。在一个方面，本文提供测试CRISPR/Cas核酸酶体内修饰目标基因组基因座的能力的方法。一些这样的方法包括：(a)向非人类动物体内引入设计为靶定目标基因组基因座的向导RNA靶向序列的向导RNA，其中，所述非人类动物包括基因组整合的Cas表达盒，该表达盒包括NLS-Cas编码序列，并且，其中，向导RNA通过腺相关病毒(AAV)介导的递送被引入；以及(b)评价对目标基因组基因座的修饰。一些这样的方法包括：(a)向非人类动物体内引入设计为靶定目标基因组基因座的向导RNA靶向序列的向导RNA，其中，所述非人类动物包含基因组整合的Cas表达盒，该表达盒包括NLS-Cas编码序列，并且，其中，所述向导RNA通过脂质纳米颗粒(LNP)介导的递送被引入，以及(b)评价对所述目标基因组基因座的修饰。在一些这样的方法中，所述AAV是AAV7,AAV8,或AAV9，步骤(b)包括对肝脏中的目标基因组基因座的修饰进行评价。任选地，AAV是AAV8。在一些这样的方法中，向所述非人类动物给药AAV的途径是静脉内注射，脑实质内注射，腹膜内注射，鼻灌注或玻璃体内注射。在一些这样的方法中，在步骤(a)中引入外源供体核酸，其中，所述外源供体核酸被设计为与所述目标基因组基因座重组。任选地，所述外源供体核酸是单链寡脱氧核苷酸(ssODN)。在一些这样的方法中，所述非人类动物是大鼠或小鼠。任选地，所述非人类动物是小鼠。在一些这样的方法中，所述目标基因组基因座包括目标基因，并且步骤(b)包括测量所述目标基因的表达或所述目标基因编码的蛋白质的活性。在一些这样的方法中，步骤(b)包括对分离自所述非人类动物的一种或多种细胞中的目标基因组基因座进行测序。在一些这样的方法中，步骤(b)包括从所述非人类动物中分离目标器官或组织并且评价对所述目标器官或组织中的目标基因组基因座的修饰。任选地，步骤(b)包括对所述目标器官或组织中的两种或多种不同的细胞类型中的目标基因组基因座的修饰进行评价。在一些这样的方法中，步骤(b)包括从所述非人类动物中分离非目标器官或组织并且评价对所述非目标器官或组织中的目标基因组基因座的修饰。在一些这样的方法中，所述NLS-Cas编码序列是NLS-Cas9编码序列。在一些这样的方法中，所述Cas表达盒还包括NLS-Cas编码序列上游的聚腺苷酸化信号，其中，所述聚腺苷酸化信号的侧面具有重组酶识别位点，并且，其中，所述Cas表达盒中的聚腺苷酸化信号已通过组织特异性方式删除。任选地，在肝脏中，所述Cas表达盒中的NLS-Cas编码序列上游的聚腺苷酸化信号已被删除。任选地，所述Cas表达盒中的识别重组酶识别位点的重组酶是Cre重组酶。任选地，所述非人类动物还包括基因组整合的Cre重组酶表达盒，其中，所述Cre重组酶表达盒包括Cre重组酶编码序列，其可操作地连接至组织特异性启动子。任选地，所述Cre重组酶基因可操作地连接至表2中列出的启动子中的一个。在一些这样的方法中，Cas表达盒还包括NLS-Cas编码序列上游的聚腺苷酸化信号，其中，所述聚腺苷酸化信号的侧面具有重组酶识别位点，并且，其中，所述方法还包括将重组酶以组织特异性的方式引入非人类动物体内。任选地，所述重组酶通过腺相关病毒(AAV)介导的递送或脂质纳米颗粒(LNP)介导的递送被引入。任选地，所述重组酶通过AAV8介导的递送被引入。任选地，所述重组酶被引入至肝脏。在一些这样的方法中，Cas表达盒还包括荧光蛋白编码序列。任选地，所述Cas表达盒包括多顺反子核酸，该多顺反子核酸包含由介入的内部核糖体进入位点(IRES)或介入的2A肽编码序列分隔开的NLS-Cas编码序列和荧光蛋白编码序列。任选地，所述Cas表达盒中的多顺反子核酸包括由介入的P2A肽编码序列分隔开的NLS-Cas编码序列和绿色荧光蛋白编码序列。在一些这样的方法中，Cas表达盒不包括荧光蛋白编码序列。在一些这样的方法中，NLS-Cas编码序列编码包含蛋白质标签的Cas蛋白质。在一些这样的方法中，Cas表达盒可操作地连接至内源启动子。在一些这样的方法中，Cas表达盒可操作地连接至外源组成性启动子。在一些这样的方法中，Cas表达盒的5’端还包括3’剪接序列。在一些这样的方法中，Cas表达盒编码包含SEQIDNO:13,16,19或22中列出的序列的蛋白质。任选地，Cas表达盒包含SEQIDNO:28,29,30或31中列出的序列。任选地，Cas表达盒包含SEQIDNO:1,12,14,15,17,18,20或21中列出的序列。在一些这样的方法中，Cas表达盒被整合至安全港基因座。任选地，所述安全港基因座是Rosa26基因座。任选地，Cas表达盒被整合至Rosa26基因座的第一内含子中。在一些这样的方法中，所述非人类动物对于Cas表达盒而言是杂合的。在一些这样的方法中，所述非人类动物对于Cas表达盒而言是纯合的。在一些这样的方法中，所述非人类动物是小鼠，AAV是AAV8，Cas表达盒可操作地连接至内源Rosa26启动子，被插入至Rosa26基因座的第一内含子中，并且在5’至3’方向上包括：(i)3’剪接序列，以及(ii)NLS-Cas9编码序列，并且步骤(b)包括评价非人类动物的肝脏中的目标基因组基因座的修饰本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测试CRISPR/Cas核酸酶体内修饰目标基因组基因座的能力的方法，其包括：/n(a)向非人类动物体内引入设计为靶向目标基因组基因座处的向导RNA靶向序列的向导RNA，/n其中，所述非人类动物包括基因组整合的包含NLC-Cas编码序列的Cas表达盒；并且/n其中，所述向导RNA通过腺相关病毒(AAV)-介导的递送被引入；以及/n(b)评价对目标基因组基因座的修饰。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170731 US 62/539,2751.一种测试CRISPR/Cas核酸酶体内修饰目标基因组基因座的能力的方法，其包括：
(a)向非人类动物体内引入设计为靶向目标基因组基因座处的向导RNA靶向序列的向导RNA，
其中，所述非人类动物包括基因组整合的包含NLC-Cas编码序列的Cas表达盒；并且
其中，所述向导RNA通过腺相关病毒(AAV)-介导的递送被引入；以及
(b)评价对目标基因组基因座的修饰。


2.如权利要求1所述的方法，其中，AAV是AAV7,AAV8,或AAV9，并且，步骤(b)包括评价对肝脏中的目标基因组基因座的修饰。


3.如权利要求2所述的方法，其中，AAV是AAV8。


4.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中，将AAV给药于所述非人类动物的途径是静脉内注射，脑实质内注射，腹膜内注射，鼻灌注或玻璃体内注射。


5.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中，在步骤(a)中引入外源供体核酸，其中，所述外源供体核酸被设计为与所述目标基因组基因座重组。


6.如权利要求5所述的方法，其中，所述外源供体核酸是单链寡脱氧核苷酸(ssODN)。


7.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述非人类动物是大鼠或小鼠。


8.如权利要求7所述的方法，其中，所述非人类动物是小鼠。


9.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述目标基因组基因座包括目标基因，并且步骤(b)包括测量目标基因的表达或由目标基因编码的蛋白质的活性。


10.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤(b)包括对分离自所述非人类动物的一种或多种细胞中的目标基因组基因座进行测序。


11.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤(b)包括从所述非人类动物中分离目标器官或组织并且评价对所述目标器官或组织中的目标基因组基因座的修饰。


12.如权利要求11所述的方法，其中，步骤(b)包括评价对所述目标器官或组织中的两种或多种不同的细胞类型中的目标基因组基因座的修饰。


13.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤(b)包括从所述非人类动物中分离非目标器官或组织并且评价对所述非目标器官或组织中的目标基因组基因座的修饰。


14.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述NLS-Cas编码序列是NLS-Cas9编码序列。


15.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述Cas表达盒还包括NLS-Cas编码序列上游的聚腺苷酸化信号，其中，所述聚腺苷酸化信号的侧面具有重组酶识别位点，并且，其中，所述Cas表达盒中的聚腺苷酸化信号以组织特异性的方式被删除。


16.如权利要求15所述的方法，其中，在肝脏中已删除了NLS-Cas编码序列上游的聚腺苷酸化信号。


17.如权利要求15或16所述的方法，其中，所述识别所述Cas表达盒中的重组酶识别位点的重组酶是Cre重组酶。


18.如权利要求17所述的方法，其中，所述非人类动物还包含基因组整合的Cre重组酶表达盒，所述Cre重组酶表达盒包含可操作地连接至组织特异性启动子的Cre重组酶编码序列。


19.如权利要求17或18所述的方法，其中，所述Cre重组酶基因可操作地连接至表2列出的启动子中的一个。


20.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中，所述Cas表达盒还包含NLS-Cas编码序列上游的聚腺苷酸化信号，其中，所述聚腺苷酸化信号的侧面具有重组酶识别位点，并且，其中，所述方法还包括以组织特异性的方式向所述非人类动物体内引入重组酶。


21.如权利要求20所述的方法，其中，所述重组酶通过腺相关病毒(AAV)-介导的递送或脂质纳米颗粒(LNP)-介导的递送被引入。


22.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述Cas表达盒还包含荧光蛋白编码序列。


23.如权利要求22所述的方法，其中，所述Cas表达盒包括多顺反子核酸，所述多顺反子核酸包含由介入的内部核糖体进入位点(IRES)或介入的2A肽编码序列分隔开的NLS-Cas编码序列和荧光蛋白编码序列。


24.如权利要求23所述的方法，其中，所述Cas表达盒中的多顺反子核酸包括由介入...

【专利技术属性】
技术研发人员：国春·龚，查琳·亨特，大辅·梶村，苏珊娜·哈特福德，布莱恩·扎姆布罗维兹，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US