一种磺胺类药物半抗原、人工抗原及其在免疫检测中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种磺胺类药物半抗原、人工抗原及其在免疫检测中的应用，属于免疫检测领域。半抗原结构中具有两个胺基苯磺酰胺的结构，使得制备而成的人工抗原的空间结构更突出，更有利于呈现磺胺类药物的共有特征基团胺基苯磺酰胺，提高了抗原的免疫原性，将人工抗原结合ELISA检测技术，磺胺二甲嘧啶的IC50值为0.5μg/L；使用本发明专利技术制备的磺胺类药物胶体金免疫层析试纸条，可以实行快速、准确的检测。

A sulfonamides hapten and artificial antigen and their application in immunoassay

【技术实现步骤摘要】
一种磺胺类药物半抗原、人工抗原及其在免疫检测中的应用
本专利技术属于免疫检测领域，特别涉及一种磺胺类药物半抗原、人工抗原及其在免疫检测中的应用。
技术介绍
磺胺类药物(Sulfonamides，SAs)是一类具有对氨基苯磺酰胺结构特征、用于预防和治疗细菌感染性疾病的人工合成类治疗药物。因其具有广谱、方便易得等特点，通常以亚治疗浓度的药物做为饲料添加剂以预防疾病，提高饲料的转化率和促进动物生长。但人类不合理使用甚至滥用，易造成SAs在动物组织中残留，继而通过食物链等途径在人体内蓄积，危害人类健康。世界规定了动物性食品中磺胺类药物的最高残留限量(MRLs)。除了从源头上控制SAs的滥用外，对动物源食品中药物的残留进行检测及监控，也是保障食品安全的重要措施。目前，磺胺类药物残留的检测方法主要有微生物学法、理化分析方法和免疫法等。微生物学法简便、费用低，但操作费时且敏感性、特异性等特性较差，在定性定量上都存在困难，不能满足现代残留检测的需要，甚至有些检测结果还达不到最高残留限量的要求。理化分析方法常作为验证方法用于测定动物组织中的药物残留，如气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、气-质联用(GC-MS)、液-质联用(HPLC-MS)等但由于设备仪器昂贵，检测时间长，且需专业人员操作，因此无法实现真正意义上的现场快速检测。而免疫学检测技术因其具有经济、快速、技术要点低、操作简便等特点，非常适用于复杂基质痕量组分的分离或检测。免疫分析检测技术现已逐渐成为快速筛选检测有毒有害残留物的主要方法之一，也为磺胺类药物的检测提供了新的途径。免疫分析检测技术的关键是抗原和抗体的性能决定的，而抗原和抗体的关键又是基于相应药物的半抗原。虽然磺胺类药物本身具有活性基团，但由于药物的活性基团就是磺胺类药物的强识别基团，直接制备的人工抗原存在灵敏度差、交叉反应率低的缺点，无法满足现有市场的需求。因此需设计出具有更高识别度的完全抗原成为亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的首要目的提供一种磺胺类药物半抗原。本专利技术的再一目的提供一种磺胺类药物人工抗原。本专利技术的又一目的提供磺胺类药物人工抗原在免疫检测中的应用。为达到上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术第一个方面，提出了一种半抗原，所述半抗原具有的结构式如下：本专利技术第二个方面，提出了前面所述半抗原的制备方法，包括如下步骤：1)化合物a和化合物b反应得到化合物c；2)化合物c水解得到半抗原其中，化合物a的结构式为化合物b的结构式为化合物c的结构式为根据本专利技术的实施例，包括以下步骤：(1)将化合物a和化合物b在三乙胺条件下发生取代反应，经萃取和柱层析纯化后得化合物c；(2)化合物c在强碱条件下发生水解反应，经萃取和重结晶后得半抗原。本专利技术第三个方面，提出了一种人工抗原，所述人工抗原为前面所述的半抗原与蛋白载体偶联得到，所述人工抗原结构式如下：其中，protein为蛋白载体。根据本专利技术的实施例，蛋白载体为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的任意一种。本专利技术第四个方面，提出了一种如前面所述人工抗原的制备方法，包括如下步骤：将前面所述半抗原与蛋白载体连接，得到所述人工抗原本专利技术第五个方面，提出了一种磺胺类药物单克隆抗体，使用前面所述的半抗原或前面任一所述的人工抗原制备得到。本专利技术第六个方面，提出了前面所述的人工抗原和前面所述的磺胺类药物单克隆抗体在ELISA检测方法中的应用。本专利技术第七个方面，提出了前面所述的人工抗原和前面所述的磺胺类药物单克隆抗体在免疫层析中的应用。本专利技术第八个方面，提出了一种磺胺类药物胶体金免疫层析试纸条，所述试纸条中的反应膜包被有前面所述的人工抗原，在一些实施例中，制备方法包括以下步骤：1)纳米金标记的磺胺类药物单克隆抗体的制备：将前面所述的磺胺类药物单克隆抗体与纳米金在弱碱下混匀后，离心，加入金子保护剂重悬，得到纳米金标记的磺胺类药物单克隆抗体；2)金垫的制备：用金子稀释液将纳米金标记的磺胺类药物单克隆抗体稀释，涂抹在玻璃纤维膜上得到纳米金标记的磺胺类药物单克隆抗体金垫；3)用PBS缓冲液配备系列浓度的磺胺类药物标准溶液，取标准溶液滴入试纸条的上样孔中，肉眼判读T/C线显色深度，当T线显色比C线深或者一样深，则判为阴性，但T线显色比C线浅则判为阳性；通过标准溶液加标空白样本，判读结果，可实现样本中磺胺类药物的快速定量检测。根据本专利技术的实施例，所述的磺胺类药物胶体金免疫层析试纸条，所述的金子稀释液包括Tris、牛血清蛋白、硫柳汞和蔗糖。本专利技术的有益效果是：本专利技术制备的半抗原不仅保留了磺胺类药物的共有特征基团胺基，而且在一个半抗原的分子结构上具有了两个胺基苯磺酰胺的特征结构，使得制备的人工抗原的空间结构更突出，更有利于呈现磺胺类药物的共有特征基团胺基苯磺酰胺，提高了抗原的免疫原性和灵敏度，且对磺胺类药物具有较高的交叉反应率，将人工抗原结合ELISA检测技术，磺胺二甲嘧啶的IC50值为0.5μg/L；使用本专利技术制备的磺胺类药物胶体金免疫层析试纸条，实行了快速、准确的检测。附图说明图1为本专利技术制备的磺胺类半抗原质谱图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术中的技术方案进行清楚、完整的说明，但并不局限于此。实施例1磺胺类药物半抗原及其制备方法一种磺胺类药物半抗原，其结构式为：该半抗原的合成路线为：制备方法如下：(1)取2.0g(12.0mmol)化合物b于100ml圆底烧瓶中，再依次加入20ml四氢呋喃，3.9g(38.5mmol)三乙胺(Et3N)，搅拌溶解后，逐滴加入含8.4g(36.0mmol)化合物a的四氢呋喃溶液40ml。滴加完毕后，反应混合物在55～65℃反应5h以上。反应完毕，减压去溶剂，加入80ml1mol/L的Na2CO3水溶液，用乙酸乙酯萃取两次，再减压去溶剂，柱层析纯化得3.6g化合物c(乙酸乙酯/石油醚，2/5，v/v)。(2)将3.6g(6.4mmol)的化合物c加入20ml1mol/L的氢氧化钠水溶液中，反应混合物在85～95℃反应5h以上，冷却至室温，用2M的稀盐酸将pH值调至4～5，然后加入乙酸乙酯萃取3次，收集有机相溶液，减压去溶剂，残留物重结晶纯化得磺胺类药物半抗原d1.1g，质谱图如图1所示，ESI-MS：463[M+1]。实施例2磺胺类药物人工抗原及其制备方法一种磺胺类药物人工抗原，其结构式为：其中Protein为载体蛋白，载体蛋白选自牛血清白蛋白、血蓝蛋白中的任意一种，该人工抗原的合成线路为：1.载体蛋白为牛血清白蛋白的磺胺类药物人工抗原，合成方法如下：1)取10mg实施例1中制备的磺胺类药物半抗原本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种半抗原，所述半抗原的结构式如下：/n

【技术特征摘要】
1.一种半抗原，所述半抗原的结构式如下：





2.一种如权利要求1所述的半抗原的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)化合物a和化合物b反应得到化合物c；
2)化合物c水解得到半抗原
其中，化合物a的结构式为
化合物b的结构式为
化合物c的结构式为


3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将化合物a和化合物b在三乙胺条件下发生取代反应，经萃取和柱层析纯化后得化合物c；
(2)化合物c在强碱条件下发生水解反应，经萃取和重结晶后得半抗原。


4.一种人工抗原，所述人工抗原为权利要求1所述的半抗原与蛋白载体偶联得到，所述人工抗原的结构式如下：



其中，protein为蛋白载体。


5.根据权利要求4所述的人工抗原，其特征在于：蛋白载体为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的任意一种。


6.一种如权利要求4或5所述人工抗原的制备方法，包括如下步骤：
将权利要求1所述半抗原与蛋白载体连接，得到所述人工抗原

【专利技术属性】
技术研发人员：李斌，王莹莹，邬秀锋，刘远高，苏振贤，黄家怡，
申请(专利权)人：广东达元绿洲食品安全科技股份有限公司，广州达元食品安全技术有限公司，广东中检达元检测技术有限公司，广东达元食品药品安全技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44