一种4-氯苯氧乙酸半抗原、人工抗原及其在免疫检测中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种4‑氯苯氧乙酸半抗原、人工抗原及其在免疫检测中的应用。本发明专利技术设计的4‑氯苯氧乙酸半抗原引入的手臂不仅具有活性基团，还可以完整保留待测目标物的羧基基团，使得半抗原与待测目标物的电子云密度保持一致，偶联简单。基于此构建的4‑氯苯氧乙酸人工抗原及单克隆抗体用于ELISA检测特异性强，IC50值为10.9μg/L；用于胶体金免疫层析技术时，灵敏度为20μg/L，实际样本中的检测限为70μg/kg，假阴和假阳性率均为0，且具有良好的特异性和稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种4-氯苯氧乙酸半抗原、人工抗原及其在免疫检测中的应用
本专利技术属于免疫检测领域，具体涉及一种4-氯苯氧乙酸半抗原、人工抗原及其在免疫检测中的应用。
技术介绍
4-氯苯氧乙酸(4-chlorophenoxyacetate，4-CPA，也俗称防落素)是一种人工合成的细胞分裂素，通常为白色或类白色晶体，难溶于水，微溶于乙醇，在酸、碱中稳定，具有抑制植物叶内叶绿素、核酸、蛋白质的分解，保绿防老的作用；还具有将氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能，广泛用在农业、果树和园艺作物从发芽到收获的各个阶段。由于4-氯苯氧乙酸药效良好、价格低廉，被当成一种生长调节剂广泛应用于无根培植豆芽的种植中。4-氯苯氧乙酸会在人体内残留并累积，长期食用会对人体产生蓄积危害。如使儿童发育早熟，女性生理发生改变，对人体有致癌、致畸的作用，即使有些危害不会在短时间内出现，但是长久沉积必然会给健康带来不利影响。原国家食品药品监督管理总局、农业部、国家卫生和计划生育委员会关于豆芽生产过程中禁止使用4-氯苯氧乙酸等物质的公告(2015年第11号)。因此加强对4-氯苯氧乙酸呤残留量监测对于保证食品质量安全十分重要。目前，用于检测4-氯苯氧乙酸的方法主要有分光光度法、高效液相色谱法及其联用技术等，这些方法虽然可以精确定量，但由于设备仪器昂贵，检测时间长，且需专业人员操作，因此无法实现真正意义上的现场快速检测；另一种检测方法为免疫学检测技术，该方法具有高特异性和高选择性的特点，非常适用于复杂基质痕量组分的分离或检测，随着学科间的相互渗透，其检测方法层出不穷，应用范围亦日益扩大，与传统检测方法相比，免疫学检测技术具有经济、快速、技术要点低、操作简便等特点。但免疫分析检测技术的关键是抗原和抗体的性能决定的，而抗原和抗体的关键又是相应的半抗原，因此，要得到性能优异的抗原和抗体，半抗原的结构设计就显得尤为重要。因此需设计出具有更高识别度的完全抗原成为亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种4-氯苯氧乙酸半抗原；本专利技术的另一目的在于提供上述的半抗原的制备方法；本专利技术的另一目的在于提供一种人工抗原；本专利技术的另一目的在于提供一种上述人工抗原的制备方法；本专利技术的另一目的在于提供一种4-氯苯氧乙酸单克隆抗体；本专利技术的另一目的在于提供上述4-氯苯氧乙酸单克隆抗体在ELISA检测方法中的应用；本专利技术的另一目的在于提供上述4-氯苯氧乙酸单克隆抗体在免疫层析中的应用；本专利技术的另一目的在于提供一种4-氯苯氧乙酸胶体金免疫层析试剂卡。本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术的第一个方面，提供：一种4-氯苯氧乙酸半抗原，该半抗原具有式I所示的结构：本专利技术的第二个方面，提供：上述的半抗原的制备方法，包括如下步骤：1)化合物a和化合物b反应得到化合物c；2)化合物c水解得到半抗原其中，化合物a的结构式为化合物b的结构式为化合物c的结构式为进一步地，上述制备方法，还包括以下步骤：(1)化合物a和化合物b在丙酮和K2CO3条件下，加热，反应至少5h，分离并萃取得到化合物c；(2)化合物c在强碱条件下，室温反应至少2h，经萃取、过滤，烘干后得到半抗原。其中，步骤(1)中的加热温度为60～70℃。步骤(1)中的萃取使用的萃取溶剂为乙酸乙酯。步骤(1)中的强碱包括氢氧化锂。本专利技术的第三个方面，提供：一种人工抗原，该人工抗原为上述的半抗原与蛋白载体偶联得到，该人工抗原的结构式如下：其中，protein为蛋白载体。进一步地，上述蛋白载体为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的任意一种。本专利技术的第四个方面，提供：一种上述人工抗原的制备方法，包括如下步骤：(1)将上述的半抗原在室温避光条件下与活化剂和蛋白载体反应16～24h；(2)加入硼氢化钠，室温避光条件下搅拌1～2h；(3)透析分离，即得人工抗原本专利技术的第五个方面，提供：一种4-氯苯氧乙酸单克隆抗体，该单克隆抗体使用上述的半抗原或上述人工抗原制备得到。本专利技术的第六个方面，提供：上述4-氯苯氧乙酸单克隆抗体在ELISA检测方法中的应用。本专利技术的第七个方面，提供：上述4-氯苯氧乙酸单克隆抗体在免疫层析中的应用。本专利技术的第八个方面，提供：一种4-氯苯氧乙酸胶体金免疫层析试剂卡，该胶体金免疫层析试剂卡反应膜上包被有上述的人工抗原。本专利技术的有益效果是：1.本专利技术设计的4-氯苯氧乙酸半抗原引入的手臂不仅具有活性基团，还完整保留了待测目标物的羧基基团，使得半抗原与待测目标物的电子云密度保持一致，偶联简单。2.本专利技术中的4-氯苯氧乙酸人工抗原及单克隆抗体用于ELISA检测特异性强，IC50值为10.9μg/L。3.本专利技术中的4-氯苯氧乙酸人工抗原及单克隆抗体用于胶体金免疫层析技术，可快速、便捷地实现4-氯苯氧乙酸的检测，本专利技术中制备的胶体金免疫层析试剂卡对4-氯苯氧乙酸检测灵敏度为20μg/L，实际样本中的检测限为70μg/kg，假阴和假阳性率均为0，且具有良好的特异性和稳定性。附图说明图1为本专利技术的4-氯苯氧乙酸半抗原的合成线路图；图2为本专利技术的4-氯苯氧乙酸人工抗原的合成线路图；图3为ELISA测试中，不同浓度的4-氯苯氧乙酸标准溶液OD值的四参数Logistic曲线拟合绘制标准曲线。具体实施方式为了使本专利技术的专利技术目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本专利技术，并非为了限定本专利技术。所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。实施例14-氯苯氧乙酸半抗原的制备一种4-氯苯氧乙酸半抗原，所述4-氯苯氧乙酸半抗原具有式I所示的结构式：如图1所示，本专利技术的4-氯苯氧乙酸半抗原通过以下方法制备，步骤如下：(1)取2.0g(12.8mmol)化合物a，依次加入20mL丙酮、3.9g(25.6mmol)化合物b和3.5g(25.6mmol)K2CO3，于70℃反应5h。反应完毕，减压去溶剂(丙酮)，加入30mL纯化水，用乙酸乙酯萃取两次，再减压去溶剂(乙酸乙酯)，柱层析纯化得2.1g化合物c(溶剂为乙酸乙酯和石油醚，乙酸乙酯和石油醚的体积比为1：5)。(2)将2.1g(8.7mmol)的化合物c溶于10mL乙醇中，再加入0.7g(17.4mmol)LiOH溶液和10mL纯化水，室温反应2h，然后加入40mL纯化水，用二氯甲烷萃取两次，水相通过2M的稀盐酸将PH值调至4～5，过滤，烘干得到半抗原。实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种4-氯苯氧乙酸半抗原，其特征在于，所述半抗原具有式I所示的结构：/n

【技术特征摘要】
1.一种4-氯苯氧乙酸半抗原，其特征在于，所述半抗原具有式I所示的结构：





2.权利要求1所述的半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)化合物a和化合物b反应得到化合物c；
2)化合物c水解得到半抗原
其中，化合物a的结构式为
化合物b的结构式为
化合物c的结构式为


3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：
(1)化合物a和化合物b在丙酮和K2CO3条件下，加热，反应至少5h，分离并萃取得到化合物c；
(2)化合物c在强碱条件下，室温反应至少2h，经萃取、过滤，烘干后得到半抗原。


4.一种人工抗原，其特征在于，所述人工抗原为权利要求1所述的半抗原与蛋白载体偶联得到，所述人工抗原的结构式如下：



其中，protein为蛋白载体。


5.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：李斌，刘远高，黄家怡，石松，
申请(专利权)人：广东达元绿洲食品安全科技股份有限公司，广东达元食品药品安全技术有限公司，广州达元食品安全技术有限公司，广东中检达元检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44