氢氯噻嗪半抗原和人工抗原及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了氢氯噻嗪半抗原和相应的人工抗原及其制备方法，所述氢氯噻嗪半抗原的结构式为

Preparation and application of hapten and artificial antigen of hydrochlorothiazide

【技术实现步骤摘要】
氢氯噻嗪半抗原和人工抗原及其制备方法和应用
本专利技术属于免疫化学
，具体涉及一种氢氯噻嗪半抗原和人工抗原及其制备方法和应用。
技术介绍
氢氯噻嗪为利尿药、抗高血压药，在临床上广泛应用。高血压为一种慢性疾病如果在平常生活得到有效控制的话病情能够得到有效缓解，所以很多人选择长期服用具有降血压的保健品，以一种安全的方式控制和降低血压。在保健食品中非法添加氢氯噻嗪等具有降血压作用的药物，很容易引起药物的副作用，危害人们的身体健康。氢氯噻嗪的研究主要集中在药代动力学研究以及对高血压治疗效果的研究。对非法添加的研究的报道不多。丁一冰等人建立人血浆氢氯噻嗪的毛细管高效液相色谱(Cap-HPLC)定量分析方法，用于氢氯噻嗪的药代动力学研究。汤卫国等人采用HPLC法测定复方氨氯地平缬沙坦氢氯噻嗪片剂中氢氯噻嗪的含量。KondawarManish等人采用高效薄层色谱法检测降血压药中氢氯噻嗪的含量。孙晓翠等人建立薄层色谱法、高效液相色谱法对添加氢氯噻嗪的清脑降压片进行分离、分析，并用高效液相色谱法-二极管阵列检测，发现检测的样品中有非法添加氢氯噻嗪的样品。目前我国氢氯噻嗪含量的检测方法主要有高效薄层色谱法、毛细管高效色谱法(Cap-HPLC)等。尽管仪器方法是氢氯噻嗪检测的验证方法，但是由于其样本前处理过程须经多步稀释、过滤、提取，制备复杂，且对操作人员的专业知识要求比较高，很难达到大量样品的快速筛查检测的要求。ELISA属于免疫分析技术，弥补了仪器分析方法的缺陷并且检测灵敏度能达到要求。因此，建立快速检测氢氯噻嗪的免疫分析方法丰富了氢氯噻嗪的研究内容，对保健食品的安全监测和氢氯噻嗪药代动力学的研究具有非常积极的作用。CN104447619A中公开了一种氢氯噻嗪半抗原和完全抗原及其制备方法，通过将氢氯噻嗪溶解于甲醇，加入碳酸钾后，与6-溴已酸乙酯反应，萃取分离得氢氯噻嗪半抗原。将氢氯噻嗪半抗原上的羧基与载体蛋白上的氨基进行偶联，得到氢氯噻嗪完全抗原。该方法是从仲胺上直接连活性手臂，仲胺极性基团直接与苯环相连，反应后的极性基团从仲胺变成叔胺，电子云密度有了明显改变，同时也在一定层度上影响了苯环的电子云密度。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种氢氯噻嗪半抗原和人工抗原及其制备方法和应用。本专利技术所采取的技术方案是：一种半抗原，所述半抗原具有式1所示的结构：上述半抗原的制备方法，包括如下步骤：1)化合物a和化合物b反应得到化合物c；2)化合物c水解得到半抗原其中，化合物a的结构式为化合物b的结构式为化合物c的结构式为一种人工抗原，所述人工抗原具有式2所示的结构：其中，protein为蛋白载体。进一步地，蛋白载体为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的任意一种。上述人工抗原的制备方法，包括如下步骤：将半抗原与蛋白质载体连接，得到所述人工抗原一种氢氯噻嗪单克隆抗体，其特征在于：使用上述半抗原或上述人工抗原制备得到。上述人工抗原和上述氢氯噻嗪单克隆抗体在ELISA检测方法中的应用。上述人工抗原和上述氢氯噻嗪单克隆抗体在荧光定量免疫层析中的应用。一种氢氯噻嗪荧光定量免疫层析试纸条，试纸条中的反应膜包被有上述人工抗原；进一步地，其制备方法包括以下步骤：1)制备包被有人工抗原和兔IGg的反应膜：将人工抗原加到包被缓冲液中混合均匀喷到反应膜的检测区，将兔IGg加到包被缓冲液中混合均匀喷到反应膜的控制区，检测区和控制区相互分离，干燥处理后保存备用；2)样品垫的制备：将裁剪好的空白样品垫浸泡在样品垫处理液中浸泡，取出样品垫干燥处理后保存备用；3)荧光定量免疫层析试纸条的组装：在背衬中部叠置反应膜，两端分别叠置样品垫和吸水垫，反应膜和吸水垫、样品垫相搭连，检测区靠近样品垫，控制区靠近吸水垫，得到试纸板，将试纸条装载于试纸卡内，得荧光定量免疫层析试纸条。一种使用上述氢氯噻嗪荧光定量免疫层析试纸条检测氢氯噻嗪的方法：1)荧光微球标记的氢氯噻嗪单克隆抗体的制备：将荧光微球活化后与上述的氢氯噻嗪单克隆抗体偶联，离心除杂，加入荧光缓冲液重悬荧光微球，得到荧光微球标记的氢氯噻嗪单克隆抗体；2)荧光微球标记的氢氯噻嗪单克隆抗体检测液的制备：用荧光缓冲液将荧光微球标记的氢氯噻嗪单克隆抗体稀释，得到荧光微球标记的氢氯噻嗪单克隆抗体检测液；3)用PBS缓冲液配备系列浓度的氢氯噻嗪标准溶液，取荧光微球标记的氢氯噻嗪单克隆抗体检测液和标准溶液混匀后滴加到荧光定量免疫层析试纸条的样品区，用荧光定量检测仪读取T/C值，通过标准溶液浓度对应的T/C值建立标准曲线，测定待测样品的T/C值，结合标准曲线即可实现氢氯噻嗪的快速定量检测。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术设计的氢氯噻嗪半抗原引入的手臂不仅具有活性基团，还完整保留了待测目标物的所有极性基团，使得半抗原与待测目标物的电子云密度几乎一致，有效的提高了小分子半抗原的免疫原性。2、本专利技术中的氢氯噻嗪人工抗原及单克隆抗体用于ELISA检测特异性强，IC50值为3.19μg/L。3、本专利技术中的氢氯噻嗪人工抗原及单克隆抗体用于荧光定量免疫层析技术，可快速、便捷地实现氢氯噻嗪的检测，本专利技术中制备的荧光定量免疫层析试纸条对氢氯噻嗪检测灵敏度为2μg/L，另外该荧光定量免疫层析试纸条精密度高，且可在室温下稳定保存一年以上，可以满足市场在保存和运输过程中的要求。附图说明图1为氢氯噻嗪半抗原质谱图。图2为ELISA检测标准曲线；图3为荧光定量免疫层析定量检测标准曲线。具体实施方式下面进一步列举实施例以详细说明本专利技术。同样应理解，以下实施例只用于对本专利技术进行进一步说明，不能理解为对本专利技术保护范围的限制，本领域技术人员根据本专利技术阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本专利技术的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。实施例1氢氯噻嗪半抗原及其制备方法一种氢氯噻嗪半抗原，其结构式为：该半抗原的合成路线为：制备方法如下：(1)取3.0g(10.5mmol)化合物a于50mL圆底烧瓶中，再依次加入20mL1,4-二氧六环，1.8g(15.7mmol)化合物b和0.3mL浓盐酸。于70～90℃反应1.5h以上。反应完毕，减压去溶剂，加入50mL饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取两次，再减压去溶剂，重结晶得1.7g化合物c(乙酸乙酯/石油醚，2/5，v/v)。(2)将1.7g(4.4mmol)化合物c溶于10mL乙醇中，加入6M的氢氧化锂溶液将化合物c的乙醇溶液的pH值调至10以上，室温反应15h以上，减压去溶剂，再加入10mL纯化水，所得溶液通过1M的稀盐酸将pH值调至4，过滤，烘干得氢氯噻嗪半抗原d645mg，质谱图如图1所示，ESI-MS：370[M+1]，392[M+23]。实施例2氢氯噻嗪人工抗原及其制备方法一种氢氯噻嗪人工抗原，其结构式为：其中Protein为载体蛋白，载体蛋白选自牛血清白蛋白、血蓝蛋白中的任意一种，该人工抗原的合成线路为：载体蛋白为牛血清白蛋白的氢氯噻嗪人工抗原的合成方法如下：1)取10mg实施例1中制备的氢氯噻嗪半抗原，溶解于0.5mL二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌充分后，加入10mgEDC和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种半抗原，所述半抗原具有式1所示的结构：

【技术特征摘要】
1.一种半抗原，所述半抗原具有式1所示的结构：2.权利要求1所述的半抗原的制备方法，包括如下步骤：1)化合物a和化合物b反应得到化合物c；2)化合物c水解得到半抗原其中，化合物a的结构式为化合物b的结构式为化合物c的结构式为3.一种人工抗原，所述人工抗原具有式2所示的结构：其中，protein为蛋白载体。4.根据权利要求3所述的人工抗原，其特征在于：蛋白载体为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的任意一种。5.权利要求3或4所述的人工抗原的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述半抗原与蛋白质载体连接，得到所述人工抗原6.一种氢氯噻嗪单克隆抗体，其特征在于：使用权利要求1所述的半抗原或权利要求3～4任一所述的人工抗原制备得到。7.权利要求3或4所述的人工抗原和权利要求6所述的氢氯噻嗪单克隆抗体在ELISA检测方法中的应用。8.权利要求3或4所述的人工抗原和权利要求6所述的氢氯噻嗪单克隆抗体在荧光定量免疫层析中的应用。9.一种氢氯噻嗪荧光定量免疫层析试纸条，其特征在于：试纸条中的反应膜包被有权利要求3或4所述的人工抗原；进一步地，其制备方法包括以下步骤：1)制备包被有人工抗原和兔IGg的反应膜：将人工抗原加到包被缓冲液中混合均匀喷到反应膜的检测区，将兔IGg...

【专利技术属性】
技术研发人员：李斌，石松，黄智永，江林峰，梁巧雯，邬秀锋，刘远高，
申请(专利权)人：广东达元绿洲食品安全科技股份有限公司，广州达元食品安全技术有限公司，广东中检达元检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44