酪氨酸酶生物发光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种式(I)所示的用于酪氨酸酶检测的生物发光探针及其制备方法和应用。本发明专利技术通过对萤光素类物质的化学修饰，连接具有与酪氨酸酶反应特异性的基团，合成了一类可用于酪氨酸酶检测的生物发光探针。该类探针对体外及细胞中的酪氨酸酶具有非常高的灵敏度和选择性。本发明专利技术的酪氨酸酶生物发光探针具有操作简便、高效专一性、快速、灵敏等优点，易于推广和应用。

Tyrosinase Bioluminescent Probe and Its Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
酪氨酸酶生物发光探针及其制备方法和应用
本专利技术公开了一类用于酪氨酸酶检测的生物发光探针及其制备方法和应用。
技术介绍
酪氨酸酶是一种含铜酶，其广泛存在于植物、动物和微生物体中，是黑色素代谢过程中的关键酶之一。酪氨酸酶不仅可以将邻位双羟基化的酚类化合物通过催化氧化作用使其转化为对应的醌，还可以在一些单羟基化的酚类化合物的羟基邻位引入第二个羟基。据报道，酪氨酸酶在黑色素瘤细胞中是过量表达的，所以在临床研究中，它可以作为一种黑色素瘤的生物标记。因此，构建一种可以快速检测酪氨酸酶的方法在生命科学及医学临床研究中具有重要意义。目前检测酪氨酸酶的方法有很多种，如电化学方法，荧光法等。但是，这些分析方法当中，电化学方法由于需要电流，会对蛋白造成一定的化学损伤从而影响检测的准确性；荧光法由于存在对激发光源的依赖性从而产生如光漂白和自发荧光等不可忽视的缺点，也限制了其进一步的应用。因此开发更加简便、快速、高效灵敏的酪氨酸酶定量检测方法仍是目前研究的一个热点。生物发光是一种存在于生物体内的特殊类型的化学发光，其本质是生物体内的萤光素酶在氧气、ATP和镁离子等存在的前提下，催化其底物萤光素发生生化反应，并以光子的形式释放能量的过程。生物发光成像技术由于其具有非侵袭性、低背景、高灵敏度、可视化以及能够实现实时动态观测等优点而得到广泛关注，逐渐发展，成为一种重要的活体成像手段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一类可用于酪氨酸酶检测的化合物，所述化合物用作生物发光探针对体内和体外酪氨酸酶的检测具有非常高的灵敏度和选择性。本专利技术的另一目的在于提供上述化合物的制备方法。本专利技术的又一目的在于提供上述化合物在酪氨酸酶检测中的应用。本专利技术目的通过如下技术方案实现：如下式(I)所示的化合物：其中，R1、R2、R3相同或不同，彼此独立地选自H、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-CO-C1-6烷基、-CO-NH-C1-6烷基、-COOC1-6烷基、F、Cl、Br、I、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基；X选自O或NR5；Y选自S或NR6；Z选自S、Se或Te；R5、R6相同或不同，彼此独立地选自H或C1-6烷基。根据本专利技术的实施方案，R1、R2、R3相同或不同，彼此独立地选自H、C1-3烷基、C1-3烷氧基；例如R1、R2、R3彼此独立地选自下列基团：H，-CH3、-OCH3。根据本专利技术的实施方案，X选自O或NH。根据本专利技术的实施方案，Y、Z选自S。作为实例，所述式(I)化合物选自如下化合物：本专利技术还提供上述式(I)化合物的制备方法，包括如下步骤：其中，R1、R2、R3、X、Y、Z如上面所定义；(a)将式(II)化合物与D-半胱氨酸盐酸盐、或硒基-D-半胱氨酸盐酸盐或碲基-D-半胱氨酸盐酸盐反应，得到式(I)化合物。根据本专利技术，步骤(a)中，所述反应在溶剂环境下进行；所述溶剂为醇类溶剂、卤代烷烃类溶剂和水构成的混合溶剂；优选为甲醇、二氯甲烷和水构成的混合溶剂。根据本专利技术，所述反应在催化剂的存在下进行，所述催化剂选自碱金属的碳酸盐或碳酸氢盐，例如为碳酸钾。根据本专利技术，式(II)化合物与D-半胱氨酸盐酸盐或硒基-D-半胱氨酸盐酸盐或碲基-D-半胱氨酸盐酸盐的摩尔比为1:(1～2)，例如为1:1。根据本专利技术，所述制备方法可以采用如下步骤：将化合物(II)溶解于溶剂中(例如为甲醇和二氯甲烷的混合溶剂)，再加入用甲醇和去离子水溶解的D-半胱氨酸盐酸盐或硒基-D-半胱氨酸盐酸盐或碲基-D-半胱氨酸盐酸盐和碳酸钾溶液，反应得到式(I)化合物。根据本专利技术，所述制备方法还包括式(II)化合物的制备，式(II)化合物可以由如下方法制备，包括：其中，R1、R2、R3、X、Y如上面所定义；L选自离去基团，例如为Cl、Br、I；(b)将化合物(A)和化合物(B)进行反应，得到式(II)化合物。根据本专利技术，步骤(b)中，所述反应在溶剂中进行，所述溶剂可为腈类溶剂，例如乙腈。根据本专利技术，所述反应在催化剂的存在下进行，所述催化剂选自碱金属的碳酸盐或碳酸氢盐，例如为碳酸钾。根据本专利技术，反应温度优选为60-100℃，例如85℃。根据本专利技术，化合物(A)与化合物(B)的摩尔比为(1～3):1，例如为3：1。本专利技术所述式(I)化合物的合成步骤简单，反应时间短，提纯方便，工艺简单。本专利技术通过对萤光素类物质进行化学修饰，引入具有与酪氨酸酶反应特异性的基团，得到了一类可用于酪氨酸酶检测的生物发光探针。在萤光素/氨基萤光素类物质中，当其6’位为羟基/氨基时，其可以在萤光素酶、ATP和Mg2+的存在下发生生物发光。本专利技术化合物以这些可以发光的萤光素/氨基萤光素类物质为母体，将能够识别酪氨酸酶的基团链接到萤光素/氨基萤光素的6’位羟基/氨基上。本专利技术化合物作为底物并不能被荧光素酶识别，不具有发光能力。而当本专利技术化合物遇到酪氨酸酶后，化合物中的识别基团与酪氨酸酶发生反应，从而释放出萤光素/氨基萤光素类物质，在ATP、Mg2+和萤光素酶的作用下发生生物发光(具体实例参见图1)。该类探针对酪氨酸酶有很好的选择性和灵敏度，可用作酪氨酸酶的生物发光探针。本专利技术还提供式(I)化合物用作酪氨酸酶生物发光探针的用途。本专利技术还提供一种检测酪氨酸酶的方法，包括将式(I)化合物施用于需要检测的样品。根据本专利技术，所述检测可以在缓冲溶液中进行。根据本专利技术，所述缓冲溶液选自HEPES缓冲溶液，Tris-HCl缓冲溶液，或PBS缓冲溶液等。根据本专利技术，所述检测在ATP、萤光素酶和镁离子的存在下进行。根据本专利技术，所述检测在含有氧气的环境下进行。本专利技术式(I)化合物对酪氨酸酶的检测具有专一性，而对其他活性氧物种、氨基酸及其他生物体内酶则无响应。根据本专利技术，所述检测可用于体外或体内酪氨酸酶的检测。本专利技术所述式(I)化合物可用于细胞内酪氨酸酶成像，用于区分黑色素瘤细胞和其他细胞中酪氨酸酶含量的变化。例如所述式(I)化合物可用于小鼠体内酪氨酸酶成像。本专利技术还提供式(I)化合物在制备用于检测酪氨酸酶的试剂中的应用。术语定义和说明：除非另有定义，否则本文所有科技术语具有的涵义与权利要求主题所属领域技术人员通常理解的涵义相同。应理解，上述简述和下文的详述为示例性且仅用于解释，而不对本申请主题作任何限制。在本申请中，除非另有说明，所用术语“包括”以及其它形式，例如“包含”、“含”和“含有”并非限制性。术语“烷基”指具有1-6个，优选1-3个碳原子的直链或支链烷基，所述烷基例如为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、新戊基。术语“芳基”应理解为优选表示具有6～20个碳原子的一价芳香性或部分芳香性的单环、双环或三环烃环，优选“C6-14芳基”。术语“C6-14芳基”应理解为优选表示具有6、7、8、9、10、11、12、13或14个碳原子的一价芳香性或部分芳香性的单环、双环或三环烃环(“C6-14芳基”)，特别是具有6个碳原子的环(“C6芳基”)，例如苯基；或联苯基，或者是具有9个碳原子的环(“C9芳基”)，例如茚满基或茚基，或者是具有10个碳原子的环(“C10芳基”)，例如四氢化萘基、二氢萘基或萘基，或者是具有13个碳原子的环(“C13芳基”)，例如芴基，或者是具有14个碳原子的环(“C14芳基”)，例如蒽基。术语“本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.如下式(I)所示的化合物：

【技术特征摘要】
1.如下式(I)所示的化合物：其中，R1、R2、R3相同或不同，彼此独立地选自H、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-CO-C1-6烷基、-CO-NH-C1-6烷基、-COOC1-6烷基、F、Cl、Br、I、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基；X选自O或NR5；Y选自S或NR6；Z选自S、Se或Te；R5、R6相同或不同，彼此独立地选自H或C1-6烷基。2.权利要求1所述的化合物，其特征在于，R1、R2、R3相同或不同，彼此独立地选自H、C1-3烷基、C1-3烷氧基；X选自O或NH；Y、Z选自S。3.权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，所述式(I)化合物选自如下化合物：4.权利要求1-3任一项所述化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：其中，R1、R2、R3、X、Y、Z如权利要求1-3任一项所定义；(a)将式(II)化合物与D-半胱氨酸盐酸盐、或硒基-D-半胱氨酸盐酸盐或碲基-D-半胱氨酸盐酸盐反应，得到式(I)化合物。5.权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述反应在催化剂的存在下进行，所述催化剂选自碱金属的碳酸盐或碳酸氢盐；优选地，式(II)化合...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨国强，李双，胡睿，王双青，郭旭东，苏磊，
申请(专利权)人：中国科学院化学研究所，中国科学院大学，
类型：发明
国别省市：北京,11