三聚氰胺半抗原和人工抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了三聚氰胺半抗原和人工抗原及其制备方法与应用，所述半抗原的结构如式I所示：

Melamine hapten and artificial antibody and their preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
三聚氰胺半抗原和人工抗体及其制备方法与应用
本专利技术涉及免疫化学
，具体涉及一种三聚氰胺半抗原和人工抗体及其制备方法与应用。
技术介绍
三聚氰胺，分子式C3N6H6，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物。三聚氰胺最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂的原料，也广泛应用于材料、电气和医药等行业。蛋白质的检测常用“凯氏定氮法”通过测定氮含量估算蛋白质含量，蛋白质主要由氨基酸组成，其氮含量通常不高于30％，而三聚氰胺的氮含量高达66％。因其含氮量较高，所以常被不法厂商非法添加到食品或饲料中，用于提高食品蛋白质中氮原子含量的测定。三聚氰胺被摄入人体后，通过小肠吸收进入血液循环并最终进入肾脏，形成肾结石，尤其对于哺乳期的婴儿，更容易造成结石，危害极大。经研究表明，动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，甚至会诱发膀胱癌。因此，为了保障食品安全，迫切需要建立一种快速准确、成本低以及适合大规模推广的三聚氰胺检测方法。目前我国三聚氰胺含量的检测方法主要有高效色谱法和免疫层析法。尽管仪器方法是三聚氰胺检测的确证方法，但是由于其样本前处理过程繁琐，制备复杂，且对需要昂贵的仪器设备及专业的操作技术人员，因此，很难达到大量样品的快速筛查检测的要求。而免疫分析技术弥补了仪器分析方法的不足，现已成为市场快速筛查手段的主流技术。免疫分析技术的核心是抗原抗体。在现有技术中，专利CN101402683B中公开了一种三聚氰胺半抗原和完全抗原及其制备方法，此方法采用戊二醛直接与三聚氰胺偶联，其不足之处在于戊二醛与蛋白上的胺基反应时，产物不单一，副反应较多，生成的碳氮双键稳定性较差，同时也影响了三聚氰胺的电子云密度；专利CN101643453B中公开的一种三聚氰胺半抗原的连接臂直接引入了强电子基团苯环，对整个结构的电子云密度影响较大。因此，合成出稳定、高效和灵敏度的半抗原和抗原以应用于三聚氰胺含量及免疫检测具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种三聚氰胺半抗原，其有两个三聚氰胺的特征结构，该结构稳定，能够用于样品中三聚氰胺含量及免疫检测，具有检测快速、操作简便和灵敏度高等优点。本专利技术还提出上述半抗原的制备方法。本专利技术还提出一种由上述半抗原制得的人工抗原。本专利技术还提出上述人工抗原的制备方法。本专利技术还提出上述人工抗原的应用。根据本专利技术的第一方面实施例的三聚氰胺半抗原，所述半抗原具有式I所示的结构：根据本专利技术实施例的三聚氰胺半抗原，至少具有如下有益效果：本专利技术设计的三聚氰胺半抗原引入的手臂不仅具有活性基团，还完整保留了待测目标物(三聚氰胺)的所有胺基，使得半抗原与待测目标物的电子云密度一致；同时，该半抗原结构中有两个待测目标物的特征结构，使得半抗原在载体蛋白中的空间位置更加突出，增加了识别位点，有效的提高了小分子半抗原的抗原性。根据本专利技术的第二方面实施例的上述半抗原的制备方法，以2-氯-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪和3,4-二氨基丁酸为原料，在碱性环境下及(70～90)℃温度下反应(16～24)h，得到式I所示的半抗原。根据本专利技术的第三方面实施例的人工抗原，所述人工抗原为上述半抗原与蛋白载体的偶联物；所述人工抗原具有式II所示的结构：其中，protein为蛋白载体。根据本专利技术的一些实施例，所述蛋白载体为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的至少一种。根据本专利技术的第三方面实施例的人工抗原，至少具有如下有益效果：本专利技术设计的人工抗原由上述三聚氰胺半抗原制得，引入的手臂同样具备与三聚氰胺电子云密度一致且有多个特征结构的优点，因此，有效提高了该人工抗原的免疫原性。根据本专利技术的第四方面实施例的上述人工抗原的制备方法，包括如下步骤：1)将式I所示的半抗原、EDC和N-羟基琥珀酰亚胺混合，室温反应(3～5)h，得到半抗原活化酯；2)将载体蛋白与半抗原活化酯混合，室温反应(16～24)h得到所述人工抗原。根据本专利技术第四方面实施例的制备方法，至少具有如下有益效果：该制备方法工艺简单、效率高且产物单一。根据本专利技术的第五方面实施例的上述人工抗原的应用，包括以下方面：上述人工抗原在制备三聚氰胺单克隆抗体中的应用；或上述人工抗原在ELISA检测方法中的应用；或上述人工抗原在荧光定量免疫层析检测及检测产品中的应用：一种检测三聚氰胺的荧光定量免疫层析试纸条，所述荧光定量免疫层析试纸条上包被有上述的人工抗原。根据本专利技术第五方面实施例的应用，至少具有如下有益效果：本专利技术中的三聚氰胺人工抗原及单克隆抗体用于ELISA检测特异性强，IC50值为10.02μg/L；本专利技术中的三聚氰胺人工抗原及单克隆抗体用于荧光定量免疫层析技术，可快速、便捷地实现三聚氰胺的检测，本专利技术中制备的荧光定量免疫层析试纸条对三聚氰胺检测灵敏度为10μg/L，另外该荧光定量免疫层析试纸条稳定性好，可在室温下稳定保存一年以上，可以满足市场在保存和运输过程中的要求。根据本专利技术一些实施例的上述荧光定量免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：1)反应膜的制备：所述反应膜包括检测区和质控区，将所述人工抗原喷涂到反应膜的检测区，将兔IGg喷涂到反应膜的质控区，干燥处理后保存备用；2)样品垫的制备：将裁剪好的空白样品垫浸泡在样品垫处理液中浸泡，取出样品垫干燥处理后保存备用；3)组装和剪切：在背衬中部叠置反应膜，两端分别叠置样品垫和吸水垫，反应膜和吸水垫、样品垫相搭连，检测区靠近样品垫，质控区靠近吸水垫，得到试纸板，将试纸板裁剪成所需宽度，即得荧光定量免疫层析试纸条。根据本专利技术一些实施例的利用上述荧光定量免疫层析试纸条检测三聚氰胺的方法，包括以下步骤：1)将荧光微球活化后与三聚氰胺单克隆抗体偶联，得到荧光微球标记的三聚氰胺单克隆抗体；所述三聚氰胺单克隆抗体是上述人工抗原免疫小鼠得到的；2)将上述荧光微球标记的三聚氰胺单克隆抗体用荧光缓冲液稀释，得到荧光微球标记的三聚氰胺单克隆抗体检测液；3)取上述荧光微球标记的三聚氰胺单克隆抗体检测液和标准溶液混匀后滴加到荧光定量免疫层析试纸条的样品区，用荧光定量检测仪读取T/C值，通过标准溶液浓度对应的T/C值建立标准曲线；4)测定待测样品的T/C值，结合上述标准曲线分析检测结果。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明图1为本专利技术实施例1中制备的三聚氰胺半抗原质谱图。图2为本专利技术实施例4中ELISA检测标准曲线；图3为本专利技术实施例5中荧光定量免疫层析定量检测标准曲线。具体实施方式为详细说明本专利技术的
技术实现思路
所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。实施例1：三聚氰胺半抗原及其制备方法一种三聚氰胺半本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三聚氰胺半抗原，其特征在于，所述半抗原具有式I所示的结构：/n

【技术特征摘要】
1.一种三聚氰胺半抗原，其特征在于，所述半抗原具有式I所示的结构：





2.如权利要求1所述的半抗原的制备方法，其特征在于，以2-氯-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪和3,4-二氨基丁酸为原料，在碱性环境及(70～90)℃温度下反应(16～24)h，得到式I所示的半抗原。


3.一种人工抗原，其特征在于，所述人工抗原为如权利要求1所述的半抗原与蛋白载体的偶联物；所述人工抗原具有式II所示的结构：



其中，protein为蛋白载体。


4.如权利要求3所述的人工抗原，其特征在于：所述蛋白载体为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的至少一种。


5.如权利要求3或4所述的人工抗原的制备方法，包括如下步骤：
1)将式I所示的半抗原、EDC和N-羟基琥珀酰亚胺混合，室温反应(3～5)h，得到半抗原活化酯；
2)将载体蛋白与半抗原活化酯混合，室温反应(16～24)h得到所述人工抗原。


6.如权利要求3或4所述的人工抗原在制备三聚氰胺单克隆抗体中的应用。


7.如权利要求3或4所述的人工抗原在ELISA检测方法中的应用。


8.一种检测三聚氰胺的荧光定量免疫层析试纸条，其特征在于，所述荧光定量免疫层析试纸条...

【专利技术属性】
技术研发人员：李斌，石松，黄智永，王莹莹，
申请(专利权)人：广东达元绿洲食品安全科技股份有限公司，广州达元食品安全技术有限公司，广东中检达元检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44