一种发酵生产硫酸软骨素的方法技术

本发明专利技术公开了一种发酵生产硫酸软骨素的方法，它是将硫酸软骨素生产菌种接种到生产培养基上，经过发酵培养，制得含有硫酸软骨素的发酵液；所述的生产培养基包含如下组分：碳源5‑35g/L，氮源1‑15g/L，玉米浆15‑35g/L，磷酸二氢钾5‑25g/L，磷酸氢二铵5‑25g/L，硫酸铵0.5‑2.5g/L，尿素2‑7g/L，微量元素0.5‑2g/L，氯化镁2‑10g/L，甘氨酸1‑5g/L，消泡剂0.2‑0.8g/L。在硫酸软骨素发酵培养过程中，按梯度策略补料，补料液是甘油、葡萄糖或者果糖溶液。该方法工艺技术稳定、产量高。

A method of producing chondroitin sulfate by fermentation

【技术实现步骤摘要】
一种发酵生产硫酸软骨素的方法
本专利技术属于生物制药
，尤其是一种发酵生产硫酸软骨素的方法。
技术介绍
硫酸软骨素，是一种广泛存在于动物组织的细胞外质和细胞表面的糖胺聚糖，作为治疗关节疾病的补充剂，与氨糖配合使用，具有止痛、促进软骨再生的功效，可以从根本上改善关节的问题。我国是硫酸软骨素出口第一大国，目前主要采用酶解法或者碱提-酶解法从动物骨头中制备硫酸软骨素，污水产生较多，且由于动物骨资源的贫乏，以及特殊人群(素食人群或者宗教问题等)的需求，亟需寻找一种能够替代目前市场上产品的非动物源硫酸软骨素。尽管有多篇报道可以使用微生物发酵生产硫酸软骨素，但由于产量都在1g/L以下，不具备大规模生产的条件。本专利技术通过改善发酵配方，优化发酵过程控制，达到高产硫酸软骨素的目的，具备大规模生产的条件。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种发酵生产硫酸软骨素的方法，该方法工艺技术稳定、产量高。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种发酵生产硫酸软骨素的方法，它是将硫酸软骨素生产菌种接种到生产培养基上，经过发酵培养，制得含有硫酸软骨素的发酵液；其特征在于：所述的生产培养基包含如下组分：碳源5-35g/L，氮源1-15g/L，玉米浆15-35g/L，磷酸二氢钾5-25g/L，磷酸氢二铵5-25g/L，硫酸铵0.5-2.5g/L，尿素2-7g/L，微量元素0.5-2g/L，氯化镁2-10g/L，甘氨酸1-5g/L，消泡剂0.2-0.8g/L。进一步，所述的生产培养基包含如下组分：碳源15-25g/L，氮源5-10g/L，玉米浆20-30g/L，磷酸二氢钾10-20g/L，磷酸氢二铵10-20g/L，硫酸铵1-2g/L，尿素3-6g/L，微量元素0.7-1.5g/L，氯化镁4-8g/L，甘氨酸2-4g/L，消泡剂0.25-0.6g/L。进一步，所述的碳源包含甘油、葡萄糖、果糖中的一种或多种。进一步，所述的氮源包含酵母粉、豆粕粉、大豆蛋白胨中的一种或多种。进一步，所述的酵母粉优选啤酒酵母粉或者面包酵母粉。进一步，所述的微量元素包含硫酸亚铁、钼酸钠、硫酸锰、维生素B1、维生素B2。进一步，所述的微量元素包含硫酸亚铁0.1-0.3g/L、钼酸钠0.1-0.5g/L、硫酸锰0.1-0.3g/L、维生素B10.1-0.3g/L、维生素B20.1-0.5g/L。进一步，在硫酸软骨素发酵培养过程中，培养温度为34-40℃，pH为6.5-8.5，发酵周期40-60小时。进一步，上述发酵过程中pH的控制是通过氨水调节的。进一步，在硫酸软骨素发酵培养过程中，按梯度策略补料，补料液是甘油、葡萄糖或者果糖溶液，浓度为50-75％(w/v)；0-5小时，2-5g/L/h；5-15小时，3-6g/L/h；15-35小时，5-9g/L/h；35小时-放罐，6-12g/L/h。进一步，上述补料策略中，“g/L/h”是指每小时每升发酵液补加料液的克数。本专利技术和现有技术相比的优点为：(1)硫酸软骨素作为多糖类产品，对碳源要求严格，本专利技术开发多种发酵碳源，为菌体生长提供多种选择。(2)发酵液中，硫酸软骨素作为菌体结构一部分，需要提高菌体浓度来达到高产，本专利技术在氮源和微量元素方面的搭配优化，为高密度发酵提供营养条件。(3)补料策略是影响大肠杆菌高密度发酵的关键因素，本专利技术在不同碳源的基础上，实现多梯度补料，在保证菌体生长必需的营养条件下，实现发酵液菌体高密度培养，从而达到硫酸软骨素高产的目的。具体实施方式为使本专利技术的技术方案更加清楚，下面通过具体实施例对本专利技术作进一步详细的描述。实施例1：将硫酸软骨素菌种接种到如下培养基中，甘油5g/L，葡萄糖15g/L，酵母粉4g/L，大豆蛋白胨1.5g/L，玉米浆25g/L，磷酸二氢钾10g/L，磷酸氢二铵15g/L，硫酸铵0.5g/L，尿素5g/L，维生素B10.3g/L，钼酸钠0.3g/L，硫酸亚铁0.5g/L，硫酸锰0.1g/L，维生素B20.2g/L，氯化镁5g/L，甘氨酸1.5g/L，消泡剂0.4g/L，37℃培养，氨水控制pH在6.5-6.8，使用60％葡萄糖溶液补料，补料速率策略是0-5小时，3.5g/L/h；5-15小时，4.5g/L/h；15-35小时，6.5g/L/h，35小时-放罐，9.5g/L/h。发酵周期50小时，OD600值110，CE(毛细管电泳仪，下同)检测硫酸软骨素含量3.5g/L。实施例2：将硫酸软骨素菌种接种例1的培养基中，37℃培养，氨水控制pH在7.5-8.0，使用60％甘油溶液补料，补料速率策略是0-5小时，2.5g/L/h；5-15小时，3.0g/L/h；15-35小时，6.8g/L/h，35小时-放罐，7.8g/L/h。发酵周期60小时，OD600值158，CE(毛细管电泳仪，下同)检测硫酸软骨素含量5.5g/L。实施例3：将硫酸软骨素菌种接种到如下培养基中，甘油15g/L，果糖5g/L，酵母粉10g/L，豆粕粉5g/L，玉米浆10g/L，磷酸二氢钾5g/L，磷酸氢二铵5g/L，硫酸铵0.8g/L，尿素3g/L，维生素B10.2g/L，钼酸钠0.2g/L，硫酸亚铁0.2g/L，硫酸锰0.3g/L，维生素B20.5g/L，氯化镁3g/L，甘氨酸4g/L，消泡剂0.35g/L，39℃培养，氨水控制pH在7.0-7.5，使用60％甘油溶液补料，补料速率策略是0-5小时，2.5g/L/h；5-15小时，4.8g/L/h；15-35小时，6.8g/L/h，35小时-放罐，8.7g/L/h。发酵周期55小时，OD600值143，CE(毛细管电泳仪，下同)检测硫酸软骨素含量5.2g/L。实施例4，：将硫酸软骨素菌种接种例3的培养基中，39℃培养，氨水控制pH在7.0-7.5，使用60％果糖溶液补料，补料速率策略是0-5小时，2.0g/L/h；5-15小时，3.0g/L/h；15-35小时，5.0g/L/h，35小时-放罐，6.0g/L/h。发酵周期48小时，OD600值138，CE(毛细管电泳仪，下同)检测硫酸软骨素含量4.8g/L。实施例5：将硫酸软骨素菌种接种到如下培养基中，甘油35g/L，酵母粉2g/L，豆粕粉10g/L，玉米浆20g/L，磷酸二氢钾14g/L，磷酸氢二铵12g/L，硫酸铵0.8g/L，尿素2.5g/L，维生素B10.1g/L，钼酸钠0.15g/L，硫酸亚铁0.15g/L，硫酸锰0.15g/L，维生素B20.2g/L，氯化镁8g/L，甘氨酸2g/L，消泡剂0.25g/L，37℃培养，氨水控制pH在6.8-7.0，使用60％甘油溶液补料，补料速率策略是0-5小时，2.8g/L/h；5-15小时，4.3g/L/h；15-35小时，6.2g/L/h，35小时-放罐，11.3g/L/h。发酵周期57小时，OD600值174，CE(毛细管电泳仪，下同)检测硫酸软骨素含量6.4g本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种发酵生产硫酸软骨素的方法，它是将硫酸软骨素生产菌种接种到生产培养基上，经过发酵培养，制得含有硫酸软骨素的发酵液；其特征在于：所述的生产培养基包含如下组分：碳源5-35g/L，氮源1-15g/L，玉米浆15-35g/L，磷酸二氢钾5-25g/L，磷酸氢二铵5-25g/L，硫酸铵0.5-2.5g/L，尿素2-7g/L，微量元素0.5-2g/L，氯化镁2-10g/L，甘氨酸1-5g/L，消泡剂0.2-0.8g/L。/n

【技术特征摘要】
1.一种发酵生产硫酸软骨素的方法，它是将硫酸软骨素生产菌种接种到生产培养基上，经过发酵培养，制得含有硫酸软骨素的发酵液；其特征在于：所述的生产培养基包含如下组分：碳源5-35g/L，氮源1-15g/L，玉米浆15-35g/L，磷酸二氢钾5-25g/L，磷酸氢二铵5-25g/L，硫酸铵0.5-2.5g/L，尿素2-7g/L，微量元素0.5-2g/L，氯化镁2-10g/L，甘氨酸1-5g/L，消泡剂0.2-0.8g/L。


2.根据权利要求1所述的发酵生产硫酸软骨素的方法，其特征在于：所述的生产培养基包含如下组分：碳源15-25g/L，氮源5-10g/L，玉米浆20-30g/L，磷酸二氢钾10-20g/L，磷酸氢二铵10-20g/L，硫酸铵1-2g/L，尿素3-6g/L，微量元素0.7-1.5g/L，氯化镁4-8g/L，甘氨酸2-4g/L，消泡剂0.25-0.6g/L。


3.根据权利要求1所述的发酵生产硫酸软骨素的方法，其特征在于：所述的碳源包含甘油、葡萄糖、果糖中的一种或多种。


4.根据权利要求3所述的发酵生产硫酸软骨素的方法，其特征在于：所述的氮源包含酵母粉、豆粕粉、大豆蛋白胨中的一种或多种。


5.根据权利要求4所述的发酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：张国银，何永进，
申请(专利权)人：赤峰蒙广生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙;15