一种高效制备聚合度为2-6的壳寡糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效制备聚合度为2‑6的壳寡糖的方法，属于壳寡糖制备技术领域。本发明专利技术采用壳聚糖酶对壳聚糖进行酶解，提供了一种生产周期较短、绿色环保的制备聚合度为2‑6的壳寡糖方法；通过控制底物浓度、加酶量和反应时间，可将90.65％的底物彻底转化为聚合度为2‑6的壳寡糖，无需膜过滤及有机溶剂沉淀，并且对常见危害广泛的植物病原菌有较好的抑制作用。

An efficient method for the preparation of chitosan oligosaccharides with polymerization degree of 2-6

【技术实现步骤摘要】
一种高效制备聚合度为2-6的壳寡糖的方法
本专利技术涉及一种高效制备聚合度为2-6的壳寡糖的方法，属于壳寡糖制备

技术介绍
壳寡糖(ChitosanOligosaccharides，COS)是通过β-1,4糖苷键连接而成的聚合度为2-10的寡糖，是目前仅知的唯一的碱性寡糖，具有低黏性、高水溶性、高生物相容性和高生物降解性的特点。以往的研究表明，壳寡糖的生物活性和聚合度(DegreeofPolymerization，DP)相关，聚合度在3-6的壳寡糖不仅是植物病原菌的抑制剂还是植物生长的促进剂，因此在农业领域有广泛的应用前景。在制备壳寡糖的化学法、物理法和酶解法中酶解法因条件温和、选择性高，对环境污染小，产物安全性好，受到越来越多的重视与关注。降解壳聚糖的酶包括非特异性酶(如溶菌酶、纤维素酶、脂肪酶等)以及特异性酶壳聚糖酶。与壳聚糖酶相比，非特异性酶虽能降解壳聚糖生成壳寡糖，但降解反应速率低、生理生化活性低、反应酶量多、水解产物复杂；而采用专一性更高壳聚糖酶(EC3.2.1.132)水解生产低聚壳聚糖将比非专一性的其他酶效率更高，水解更彻底。已经报道的壳聚糖酶水解壳聚糖的最终产物多为DP为2-3或2-4的壳寡糖，显然与实际需求还有差距。目前已经有很多策略被尝试用来获得目标聚合度壳寡糖。利用非专一性酶制备壳寡糖，如专利CN201610053286.9，利用纤维素酶水解壳聚糖5h，经高温灭酶，载体吸附和低温真空干燥后制备分子量和性质均一的低聚窄分布壳寡糖，但此方法未提及壳寡糖分子量分布及聚合度情况。采用复合酶来制备壳寡糖，如专利CN201110405284.9一种应用复合酶制备壳寡糖的方法，采用纤维素酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、葡萄糖酶、木瓜蛋白酶复合酶在50-60℃摇床震荡降解壳聚糖2-3h，通过5000D分子筛和300D分子筛获得聚合度在2-30(分子量为300-5000D)的壳寡糖；采用分段水解方法制备壳寡糖，如专利CN201810272348.4公布了一种提高壳寡糖聚合度3-6糖含量的制备方法，该方法利用三段酶解的手段制备，通过优化pH和反应温度优化组合，再通过微滤(0.45μm)和纳滤(500D)得到聚合度为3-6的壳寡糖，三个阶段酶解周期大概为9-14h；利用有机溶剂沉淀法制备目标聚合度的壳寡糖，如CN200710067143.4公布一种制备聚合度为4-7的壳寡糖的方法，以脱乙酰度为75-95％壳聚糖为原料，经壳聚糖酶水解后，当水解液中性溶液折光率为70％-85％终止反应，100℃灭酶后，离心取上清用85％-95％的丙酮或乙醇选择性沉淀制备聚合度4-7的壳寡糖，得率为85％-90％。采用物理方法制备壳寡糖，CN201310270184.9公布了一种超声微波协同氧化制备低聚窄分子量分布壳寡糖的方法，该法现在壳聚糖胶体中加入双氧水搅拌2-20分钟，再超声5-40分钟，经微波处理后调pH至中性，醇沉得到窄分布的不同聚合度的壳寡糖，但未提及所制备壳寡糖聚合度分布和分量分布。综上，现有上述目标聚合度壳寡糖制备方法存在生产周期长，所制备壳寡糖分子量分布较宽，较窄的分子量分布需要投入膜处理设备，有机溶剂选择性沉淀会增加安全隐患等缺点。
技术实现思路
为了克服上述技术中存在的不足之处，本专利技术提供一种生产周期较短、绿色环保的制备聚合度为2-6的壳寡糖方法。通过控制底物浓度、加酶量和反应时间，可将90.65％的底物彻底转化为聚合度为2-6的壳寡糖，无需膜过滤及有机溶剂沉淀，并且对常见危害广泛的植物病原菌有较好的抑制作用。本专利技术的第一个目的是提供一种聚合度为2-6的壳寡糖的制备方法，所述方法包括：(1)底物溶解：将壳聚糖(脱乙酰度≥95％)先溶于0.1～0.5M乙酸溶液，再调pH至4～6，配制成壳聚糖溶液；(2)酶解：向壳聚糖溶液中加入壳聚糖酶，40～60℃下进行酶解反应；(3)去杂：加碱沉降未反应完的壳聚糖，高温灭酶，离心去除酶和残余壳聚糖，得到聚合度为2-6的壳寡糖混合物。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(1)中壳聚糖(脱乙酰度≥95％)先溶于0.1～0.5M乙酸溶液中，搅拌2-3小时，至壳聚糖完全分散均匀。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(1)中调pH至4～6，向分散均匀的壳聚糖胶体中缓慢滴加0.1～0.5MNaOH，并不断搅拌，至pH为4～6，不足体积用pH为4～6的乙酸-乙酸钠缓冲溶液补齐。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(1)中壳聚糖溶液的浓度(g/L)为0.5％～2％。在本专利技术的一种实施方式中，优选地，壳聚糖溶液的浓度为1.5～2％。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(2)中壳聚糖酶为本实验室构建的毕赤酵母工程菌GS115-pPIC9K-Csn，经高密度发酵和甲醇诱导后，发酵上清液经脱盐干燥制得，为黄绿色粉末；其中，壳聚糖酶的NCBI登录号为EU302818.1；毕赤酵母工程菌的构建参见Invitrogen公司提供的操作手册(AManualofMethodsforExpressionofRecombinantProteinsinPichiapastoris)。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(2)中壳聚糖酶与壳聚糖溶液的用量比为2.5～60U/mL。在本专利技术的一种实施方式中，优选地，壳聚糖酶与壳聚糖溶液的用量比为15～30U/mL。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(2)中，壳聚糖酶反应时间为5min～24h。在本专利技术的一种实施方式中，优选地，壳聚糖酶反应时间为2～4h。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(3)中，高温灭酶指将反应液90-100℃水浴5～15min使酶热失活。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(3)中，加碱沉降未反应壳聚糖指用1M的NaOH调整水解反应液pH至8.0，静置30min，如有未水解的壳聚糖则会沉淀。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(3)中，离心指8000rpm，5min。本专利技术的第二个目的是提供一种上述方法制备得到的聚合度为2-6的壳寡糖。本专利技术第三个目的是提供一种上述壳寡糖在作为植物病原真菌抑制剂和/或植物生长促进剂中的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述植物病原真菌包括灰葡萄孢、禾谷镰刀菌、赤星病菌、稻瘟病菌、白粉病菌和番茄早疫病菌。本专利技术的有益效果：1.现有的壳聚糖酶彻底水解壳聚糖的最终产物多为聚合度为2-3或者2-4的壳寡糖，而本专利技术的壳聚糖酶具有不能切割壳二糖、壳三糖、壳四糖及很难切割壳五糖的特点，更适合用于制备聚合度为2-6的壳寡糖。2.本专利技术只需要水解4h，即可将90.65％的壳聚糖转化为聚合度为2-6的壳寡糖，具有水解时间短，转化率高的特点。3.本专利技术制备的壳寡糖混合物对于多种植物致病真菌有较好的抑制作用。附图说明图1为壳聚糖酶粗酶粉。图2为通过TLC将Csn75对壳聚糖和COS水解的壳聚糖产物。M，标记糖，G1-G6分别代表葡糖胺，(GlcN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种聚合度为2-6的壳寡糖的制备方法，其特征在于，所述方法包括：/n(1)底物溶解：用酸溶解壳聚糖，配制成壳聚糖溶液；/n(2)酶解：向壳聚糖溶液中加入壳聚糖酶，在40～60℃下进行酶解反应；/n(3)去杂：加碱沉降未反应完的壳聚糖，高温灭酶，离心去除酶和残余壳聚糖，得到聚合度为2-6的壳寡糖混合物。/n

【技术特征摘要】
1.一种聚合度为2-6的壳寡糖的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)底物溶解：用酸溶解壳聚糖，配制成壳聚糖溶液；
(2)酶解：向壳聚糖溶液中加入壳聚糖酶，在40～60℃下进行酶解反应；
(3)去杂：加碱沉降未反应完的壳聚糖，高温灭酶，离心去除酶和残余壳聚糖，得到聚合度为2-6的壳寡糖混合物。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中壳聚糖溶液的浓度为0.5％～2％。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中壳聚糖溶液的pH为4～6。


4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中壳聚糖酶为毕赤酵母工程菌经高密度发酵和甲醇诱导后，发酵上清液经脱盐干燥制得。

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【专利技术属性】
技术研发人员：周剑丽，余晓斌，顾秋亚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32