一种同时制备野漆树苷和柚皮苷两种化学对照品的方法技术

本发明专利技术公开了一种同时制备野漆树苷和柚皮苷两种化学对照品的方法，用乙醇溶液同时提取化橘红叶中的野漆树苷和柚皮苷，提取液经减压浓缩后，用正丁醇‑石油醚混合液萃取去除叶色素，下层部分置冰箱中静置，用冷水洗涤离心，去除水溶性多糖和蛋白质等杂质，粗产品用甲醇溶解，再以高效液相制备色谱仪进行分离，即可获得纯度达98％以上的野漆树苷和柚皮苷两种黄酮对照品。本发明专利技术能同时制备野漆树苷和柚皮苷对照品，工艺步骤简单，纯度高，成本低，制备量大。

Method for simultaneously preparing two kinds of chemical reference substance of wild flower glucoside and naringin

The invention discloses a method for simultaneously preparing rhoifolin naringin and two kinds of chemical control methods, and the extraction of orange leaves in rhoifolin and naringin in ethanol solution, the extract was concentrated and then, with butanol petroleum ether mixture extraction to remove leaf pigment, the lower part is provided the refrigerator in standing, washed with water and centrifuged to remove water soluble polysaccharide protein and other impurities, the crude product was dissolved with methanol, then HPLC chromatograph separation can be obtained more than 98% purity of naringin and rhoifolin two flavonoids control. The preparation can be used for the preparation of the wild wood glucoside and the naringin contrast material at the same time. The process is simple, the purity is high, the cost is low, and the preparation quantity is large.

【技术实现步骤摘要】
一种同时制备野漆树苷和柚皮苷两种化学对照品的方法
本专利技术涉及药物制备
，具体是一种同时制备野漆树苷和柚皮苷两种化学对照品的方法。
技术介绍
野漆树苷（Rhoifolin），是类黄酮化合物，来源于沽油科山香圆的干燥叶和芸香科植物果实，药理作用：抗氧化，抗肿瘤，抗高血压，黄嘌呤氧化酶抑制剂，由于是黄嘌呤氧化酶抑制剂，可以有效抑制体内尿酸的生成，因而是开发治疗痛风新药的特效成分。柚皮苷（Naringin）是一种双氢黄酮类化合物，有苦味，天然存在于芸香科植物葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中，也是骨碎补、枳实、枳壳、化橘红等中药的主要有效成分之一。柚皮苷具有多方面的生物活性，例如：抗氧化作用、抗癌作用、抗炎作用、抑菌作用和降血脂等作用。目前，对相关天然产物的提取分离，药物生理活性的研究，药量药效质量控制，需要检测野漆树苷和柚皮苷的含量，因而需要使用对照品，由于柚皮柚普遍存在，对照品容易获得，价格一般（65元/20mg），野漆树苷植物来源少，其对照品价格昂贵，1300元/20mg，是柚皮苷价格的20倍。目前，野漆树苷的来源主要为中药山香圆叶或芸香科毛橘红果实，它们的含量均比较低，只占干物质的0.1～0.6％，提取分离困难，在化橘红果实中，野漆树苷不足柚皮苷的5%，而且野漆树苷与柚皮苷结构与性质高度相似，因而在提取分离中难以分开，要得到纯度高的野漆树难度更大，化橘红叶中的野漆树苷含量较高，是果实中的十几倍，叶龄越小，野漆树苷和柚皮苷的比例越大，野漆树苷含量甚至比柚皮苷的高，两者的总和占干物质量可达13%以上。溶剂法从化橘叶中提取野漆树苷，通过液液萃取分离去除叶绿素和柚皮苷，再通过结晶和重结晶可得到纯度高的野漆树苷，但是要把大量的柚皮苷去除，工艺复杂，有机溶剂用量大，得率低，成本高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种同时制备野漆树苷和柚皮苷两种化学对照品的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。本专利技术从中药化橘红叶中同时制备野漆树苷和柚皮苷两种化学对照品，包括化橘红叶经柱层析乙醇溶液提取、正丁醇-石油醚混合液萃取、水洗去除水溶性杂质、反相高效液相制备色谱精制四个步骤，从而得到野漆树苷和柚皮苷两种化学对照品。两种对照品的结构如下：为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种同时制备野漆树苷和柚皮苷两种化学对照品的方法，步骤如下：（1）化橘红叶粉末制备：摘取化橘红嫩叶，50～60℃烘箱烘干至恒重，粉碎过40～60目筛，得粉末备用；（2）柱层析法提取：叶粉末用乙醇溶液湿样上柱，用相同浓度乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得化橘红叶的乙醇提取物浸膏；（3）有机溶剂萃取除去叶色素：浸膏转移到分液漏斗，分3次用水洗涤烧瓶，合并到分液漏斗，用等体积正丁醇-石油醚混合液萃取去上层液，重复3次，得下层溶液混合物及沉淀；（4）水洗去除水溶性杂质：上述所得下层部分转置4℃冰箱静置12～20h，用冷水洗涤离心，去除水溶性多糖和蛋白质杂质，得粗产品；（5）反相高效液相制备色谱精制：粗产品混合物以甲醇-水溶液溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，以反相高效液相制备色谱仪分离，甲醇-水溶液为洗脱系统，325nm检测，分别收集制备色谱中的两个色谱峰物质，减压回收溶剂，48～52℃恒温真空干燥22～26h，即得野漆树苷和柚皮苷两个化学对照品。作为本专利技术进一步的方案：所述步骤（1）中的嫩叶是抽出10～20天的嫩叶。作为本专利技术进一步的方案：所述步骤（2）中层析柱直径为2～8cm，上样的高径比为9～11，洗脱液体积浓度为70～95%，收集洗脱液体积3～8倍量，减压温度45～80℃。作为本专利技术进一步的方案：所述步骤（3）中正丁醇-石油醚混合液其体积比为0.5～1.5：9.5～8.5，萃取3～4次。作为本专利技术进一步的方案：所述步骤（4）中水洗去除水溶性杂质时，用水量是样品体积2～4倍，离心转速4000～10000r/min，重复3次。作为本专利技术进一步的方案：所述步骤（5）中野漆树苷和柚皮苷的混合物以60％的甲醇溶解，样品浓度为20～30mg/mL，反相高效液相制备色谱柱为ODS-C18。作为本专利技术进一步的方案：所述步骤（5）中，反相高效制备液相进样体积为1～4mL，流速为10～15mL/min，流动相为甲醇-水溶液，梯度洗脱，时间程序：30%甲醇（0～5min），30～50%甲醇（5～25min）。作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤（5）中，收集保留时间分别为13.5min和20.0min的馏分。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1、本专利技术首次从化橘红叶中制备野漆树苷和柚皮苷两个化学对照品，效率高，成本低，有效利用化橘红叶资源，开辟了两种化学对照品制备的新途径，特别是野漆树苷对照品的来源。2、本专利技术工艺简单，化橘红叶经乙醇提取、正丁醇-石油醚萃取、反相高效液相制备色谱精制三个步骤，即可同时获得纯度大于98％的野漆树苷和柚皮苷两个化学对照品。3、本专利技术成本低，绿色环保。原料资源化橘红叶来源丰富、价廉，它含有两种黄酮总和占干物质的6～13.8%，所用试剂全部可回收利用。附图说明图1为高效液相制备柚皮苷与野漆树苷色谱图（325nm），从图中可看出，在325nm波长被检测到的主要为柚皮苷和野漆树苷，并且柚皮苷的保留时间先于野漆树苷约6min，因此有足够的时间差可以让它们彻底分开。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1（1）乙醇提取：将化橘红叶粉碎，过40目筛，称取1kg粉末，用95%湿法均匀装入玻璃层析柱中，用95%乙醇作洗脱液，洗脱液速度10mL/min，收集洗脱液2L。（2）正丁醇-石油醚混合液萃取：收集的洗脱液经旋转蒸发减压浓缩回收溶剂，得化橘红叶的乙醇提取物浸膏约125mL，转移到分液漏斗，分三次用少量水洗残余，合并到分液漏斗，共200mL，用200mL正丁醇-石油醚（V/V，1：9）混合液萃取3次，去除上层叶色素液，得到下层含目标成分沉淀和溶液。（3）冷却析出：把上述得到的下层部分转移到离心管中，用盐酸调节pH4，置4℃冰箱中过夜，取出冷冻离心机离心15min，转速8000r/min，去上清液，沉淀再用3倍冷水洗涤2次，得到淡绿色沉淀，即野漆树苷和柚皮苷混合物粗产品，干重7.2g。（4）反相高效液相制备色谱精制：野漆树苷和柚皮苷的混合物以60％甲醇水溶液溶解，配成浓度为30mg/mL的样品溶液，微孔滤膜过滤，色谱柱为ODS-C18（10mm×250mm，15μm），进样体积为4mL，流速为30mL/min，流动相为甲醇-水溶液，梯度洗脱，时间程序：30%甲醇（0~5min），40%甲醇（5~25min），收集保留时间分别为13.5min和20.0min的馏分，减压回收溶剂，干燥，即得柚皮苷和野漆树苷两种对照品。采用反相高效液相分析色谱分析了其纯度，纯度均达到98％以上，如图1所示。单针进样可获取野漆树苷56mg、柚皮苷45mg，收率约为89％，野漆树苷淡绿色粉末，柚皮苷为白色粉末。实施例2（1）乙醇本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时制备野漆树苷和柚皮苷两种化学对照品的方法，其特征在于，步骤如下：（1）化橘红叶粉末制备：摘取化橘红嫩叶，50～60℃烘箱烘干至恒重，粉碎过40～60目筛，得粉末备用；（2）柱层析法提取：叶粉末用乙醇溶液湿样上柱，用相同浓度乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得化橘红叶的乙醇提取物浸膏；（3）有机溶剂萃取除去叶色素：浸膏转移到分液漏斗，分3次用水洗涤烧瓶，合并到分液漏斗，用等体积正丁醇‑石油醚混合液萃取去上层液，重复3次，得下层溶液混合物及沉淀；（4）水洗去除水溶性杂质：上述所得下层部分转置4℃冰箱静置12～20h，用冷水洗涤离心，去除水溶性多糖和蛋白质杂质，得粗产品；（5）反相高效液相制备色谱精制：粗产品混合物以甲醇‑水溶液溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，以反相高效液相制备色谱仪分离，甲醇‑水溶液为洗脱系统，325nm检测，分别收集制备色谱中的两个色谱峰物质，减压回收溶剂，48～52℃恒温真空干燥22～26h，即得野漆树苷和柚皮苷两个化学对照品。

【技术特征摘要】
1.一种同时制备野漆树苷和柚皮苷两种化学对照品的方法，其特征在于，步骤如下：（1）化橘红叶粉末制备：摘取化橘红嫩叶，50～60℃烘箱烘干至恒重，粉碎过40～60目筛，得粉末备用；（2）柱层析法提取：叶粉末用乙醇溶液湿样上柱，用相同浓度乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得化橘红叶的乙醇提取物浸膏；（3）有机溶剂萃取除去叶色素：浸膏转移到分液漏斗，分3次用水洗涤烧瓶，合并到分液漏斗，用等体积正丁醇-石油醚混合液萃取去上层液，重复3次，得下层溶液混合物及沉淀；（4）水洗去除水溶性杂质：上述所得下层部分转置4℃冰箱静置12～20h，用冷水洗涤离心，去除水溶性多糖和蛋白质杂质，得粗产品；（5）反相高效液相制备色谱精制：粗产品混合物以甲醇-水溶液溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，以反相高效液相制备色谱仪分离，甲醇-水溶液为洗脱系统，325nm检测，分别收集制备色谱中的两个色谱峰物质，减压回收溶剂，48～52℃恒温真空干燥22～26h，即得野漆树苷和柚皮苷两个化学对照品。2.根据权利要求1所述的同时制备野漆树苷和柚皮苷两种化学对照品的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的嫩叶是抽出10～20天的嫩叶。3.根据权利要求1所述的同时制备野漆树苷和柚皮苷两种化学对照品的方法，其特征在于，所述步骤（2）中层析柱直径为2～...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩寒冰，尹爱国，杨培苑，李颖，刘杰凤，刘成有，
申请(专利权)人：广东石油化工学院，
类型：发明
国别省市：广东,44