本发明专利技术提供燕窝中硫酸乙酰肝素/肝素的提取方法与结构解析，属于天然产物制备纯化领域。该方法先将粉末状燕窝用胰蛋白酶酶解，再通过DEAE阴离子交换色谱柱、透析、冻干等一系列步骤得到燕窝糖胺聚糖。然后样品用肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ特异性酶解燕窝糖胺聚糖至硫酸乙酰肝素/肝素二糖，再利用分子排阻色谱法，分离纯化得到硫酸乙酰肝素二糖/肝素二糖。硫酸乙酰肝素二糖/肝素二糖以离子对试剂为流动相，利用LC/MS‑ITTOF分析二糖组分的结构并得到摩尔百分比，最后建立硫酸乙酰肝素二糖/肝素区域结构模型。
Extraction and structure analysis of heparin sulfate / heparin from bird's nest
【技术实现步骤摘要】
燕窝中硫酸乙酰肝素/肝素的提取方法与结构解析
本专利技术属于天然产物制备纯化领域，具体涉及燕窝中硫酸乙酰肝素/肝素的提取的提取方法与结构解析。
技术介绍
燕窝是指雨燕目雨燕科的部分雨燕和金丝燕属的几种金丝燕分泌出来的唾液，再混合其他物质所筑成的巢穴。干燕窝中约有蛋白质59.8%、脂肪0.04%、总糖0.11%、氨基酸总量49.68%，唾液酸含量占干重7%以上。传统医学表明燕窝入肺生气、入肾滋水、入胃补脾、补而不燥，是调理虚损的圣药。现代科学表明，燕窝燕窝中含有表皮生长因子和辅促细胞分裂成份，有助于刺激细胞生长及繁殖，对人体组织生长、细胞再生，免疫功能均有促进作用。燕窝的多种功效与糖含量有密切联系，探究燕窝中硫酸乙酰肝素/肝素，有助于进一步了解燕窝的保健和药用功效。硫酸乙酰肝素/肝素为糖胺聚糖的一大分支，是经不同程度、不同位点硫酸化和乙酰化修饰构成的聚阴离子线性长链，其中构成长链的二糖单元还会发生差向异构化。硫酸乙酰肝素/肝素二糖单元是由己糖醛酸（HexA）与葡萄糖胺（GlcN）以共价键连接而成，二糖单元主要的修饰位点有HexA的C2位O硫酸化，GlcN的N位硫酸化和N位乙酰化，C6位O硫酸化，一些稀有结构会出现C3位O硫酸化。不同程度、不同位点硫酸化和乙酰化修饰影响硫酸乙酰肝素/肝素的生物功能，与此同时，位点修饰所致的同分异构体使结构解析具有极大的难度和挑战性。硫酸乙酰肝素/肝素的生物功能主要是在细胞发育、血管生成、血液凝固、细胞黏附以及肿瘤代谢等方面发挥着重要的作用。由于国内外未见报道有关燕窝中硫酸乙酰肝素/肝素的提取方法与结构解析，本专利技术开创性的建立了一种提取燕窝中硫酸乙酰肝素/肝素的方法，并首次对燕窝中的硫酸乙酰肝素/肝素进行结构解析，为深入研究燕窝中硫酸乙酰肝素/肝素的结构及其功效提供了原创性的提取途径和结构分析手段，有助于进一步探究其在保健和药用方面的价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种燕窝中硫酸乙酰肝素/肝素的提取的提取方法与结构解析。以燕窝为原料，经酶解、离心、DEAE全洗脱一系列方法提取得到糖胺聚糖，再通过肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ特异性酶解糖胺聚糖至硫酸乙酰肝素/肝素二糖，再由分子排阻色谱柱Peptide柱对硫酸乙酰肝素/肝素二糖进行分离纯化，最后通过LC/MS-ITTOF对硫酸乙酰肝素/肝素二糖单元进行质谱结构分析，并根据硫酸乙酰肝素/肝素二糖组分的摩尔百分比建立区域结构模型。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：燕窝中硫酸乙酰肝素/肝素的提取方法与结构解析，包括以下步骤：（1）燕窝的酶解：燕窝研磨成粉末状后置于超纯水中充分浸泡，然后加入胰蛋白酶特异性酶解，酶解后超高速离心取上清液；（2）阴离子交换层析提取燕窝中的糖胺聚糖：取DEAE琼脂糖凝胶树脂装柱，先向柱内加入低盐浓度的平衡液平衡层析柱，再加入步骤(1)制得的上清液，随后加入高盐浓度洗脱液洗脱出燕窝中的糖胺聚糖；（3）肝素酶酶解糖胺聚糖至硫酸乙酰肝素/肝素二糖：DEAE洗脱出的糖胺聚糖进行透析除盐，再经冻干浓缩后，加入肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ特异性酶解糖胺聚糖至硫酸乙酰肝素/肝素二糖；（4）分子排阻色谱法分离硫酸乙酰肝素/肝素二糖：取步骤(3)中的酶解后的上清液过分子排阻色谱柱Peptide柱，以NH4HCO3为流动相并在232nm波长下进行紫外检测，收集到的二糖组分在高温下挥发除去流动相中的NH4HCO3。（5）液质联用检测燕窝硫酸乙酰肝素/肝素二糖结构：使用反相色谱柱C18柱为分析柱，醋酸铵为流动相A相，甲醇为流动相B相，通过LC/MS-ITTOF对燕窝中硫酸乙酰肝素/肝素二糖进行结构解析，并建立区域结构模型。上述步骤（1）燕窝的酶解，具体为：将燕窝研磨为粉末状，取0.1-0.2g置于20-40mL水中，常温下浸泡24-48h；再加入200μL5-10μg/μL胰蛋白酶酶解燕窝；酶缓冲液为0.1-0.2MNaCl磷酸缓冲溶液，酶解条件为36-40℃，48-72h；随后取10-20mL以10000rpm离心10-20min，取上清液。上述步骤（2）阴离子交换层析提取燕窝中的糖胺聚糖，具体为：取DEAE树脂，用超纯水洗去乙醇后装柱；先向柱内加入0.2MNaCl，10-50mM磷酸缓冲液作为平衡液平衡层析柱，待柱效稳定后，加入步骤1所得上清液，随后加入0.2MNaCl，10mMNaH2PO4/Na2HPO4溶液除去蛋白杂质，再加入2.0MNaCl，10mMNaH2PO4/Na2HPO4高盐浓度洗脱液洗脱出燕窝中的糖胺聚糖。上述步骤（3）肝素酶酶解糖胺聚糖至硫酸乙酰肝素/肝素二糖，具体为：燕窝糖胺聚糖用分子量为1000-5000Da透析膜透析2-4天，每1-3h换一次去离子水，将流动相中所含的盐除去；透析结束后，采用冻干技术除水分，再浓缩至无水状态，浓缩时的转速为1000-1200rpm，浓缩温度低于50℃；取浓缩后的样品50-100ng加入肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ酶液各10μL，酶浓度为均为0.1-1mIU/μL，配置酶液的缓冲液为0.1MNaAc，0.1mMCa(Ac)2，pH=6.5-7.5（醋酸调pH），酶解温度36-40℃，酶解时长12-48h；酶解结束，用沸水灭活5-10min，再以10000rpm离心10-20min，取上清液。上述步骤（4）分子排阻色谱法分离硫酸乙酰肝素/肝素二糖，具体为：取步骤（3）中的上清液以小于200μL过分子排阻色谱柱Peptide柱，流动相为0.1-0.2MNH4HCO3，流速为0.4mL/min，二糖收集时间为38-44min，紫外检测波长为232nm；收集到的二糖组分在55-65℃下挥发除去流动相中的NH4HCO3。上述步骤（5）液质联用检测燕窝硫酸乙酰肝素/肝素二糖结构，具体为：以C18柱为分析柱，流动相A相为10-100mM醋酸铵，流动相B相为100%甲醇，流速为0.05-0.1mL/min，CDL为100-200℃，HeatBlock为100-200℃，N2流速为1.5mL/min，检测电压为1.6-1.8kV。根据建立好的标准曲线，得到二糖组分含量和摩尔百分比，并建立区域结构模型。本专利技术的优点在于：本专利技术通过对燕窝的酶解、离心、DEAE全洗脱提取得到糖胺聚酶解，再通过肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ特异性酶解糖胺聚糖至硫酸乙酰肝素/肝素二糖，再由分子排阻色谱柱Peptide柱对硫酸乙酰肝素/肝素二糖进行分离纯化，最后通过LC/MS-ITTOF对硫酸乙酰肝素/肝素二糖单元进行质谱结构分析，并根据硫酸乙酰肝素/肝素二糖组分的摩尔百分比建立区域结构模型。本专利技术首次对燕窝中的硫酸乙酰肝素/肝素进行结构解析，为深入研究燕窝中硫酸乙酰肝素/肝素的结构及其功效提供了原创性的提取途径和结构分析手段，有助于进一步探究其在保健和药用方面的价值。附图说明图1DEAE柱所收集组分紫外检测图。H0为原样以及0.2MNaCl，10mMNaH2PO4/Na2HPO4洗脱出的杂质部分，H1为2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.燕窝中硫酸乙酰肝素/肝素的提取方法与结构解析，其特征在于，包括以下步骤：/n（1）燕窝的酶解：燕窝研磨成粉末状后置于超纯水中充分浸泡，然后加入胰蛋白酶特异性酶解，酶解后超高速离心取上清液；/n（2）阴离子交换层析提取燕窝中的糖胺聚糖：取DEAE琼脂糖凝胶树脂装柱，先向柱内加入低盐浓度的平衡液平衡层析柱，再加入步骤(1)制得的上清液，随后加入高盐浓度洗脱液洗脱出燕窝中的糖胺聚糖；/n（3）肝素酶酶解糖胺聚糖至硫酸乙酰肝素/肝素二糖：DEAE洗脱出的糖胺聚糖进行透析除盐，再经冻干浓缩后，加入肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ特异性酶解糖胺聚糖至硫酸乙酰肝素/肝素二糖；/n（4）分子排阻色谱法分离硫酸乙酰肝素/肝素二糖：取步骤(3)中的酶解后的上清液过分子排阻色谱柱Peptide柱，以NH
【技术特征摘要】
1.燕窝中硫酸乙酰肝素/肝素的提取方法与结构解析，其特征在于，包括以下步骤：
（1）燕窝的酶解：燕窝研磨成粉末状后置于超纯水中充分浸泡，然后加入胰蛋白酶特异性酶解，酶解后超高速离心取上清液；
（2）阴离子交换层析提取燕窝中的糖胺聚糖：取DEAE琼脂糖凝胶树脂装柱，先向柱内加入低盐浓度的平衡液平衡层析柱，再加入步骤(1)制得的上清液，随后加入高盐浓度洗脱液洗脱出燕窝中的糖胺聚糖；
（3）肝素酶酶解糖胺聚糖至硫酸乙酰肝素/肝素二糖：DEAE洗脱出的糖胺聚糖进行透析除盐，再经冻干浓缩后，加入肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ特异性酶解糖胺聚糖至硫酸乙酰肝素/肝素二糖；
（4）分子排阻色谱法分离硫酸乙酰肝素/肝素二糖：取步骤(3)中的酶解后的上清液过分子排阻色谱柱Peptide柱，以NH4HCO3为流动相并在232nm波长下进行紫外检测，收集到的二糖组分在高温下挥发除去流动相中的NH4HCO3；
（5）液质联用检测燕窝硫酸乙酰肝素/肝素二糖结构：使用反相色谱柱C18柱为分析柱，醋酸铵为流动相A相，甲醇为流动相B相，通过LC/MS-ITTOF对燕窝中硫酸乙酰肝素/肝素二糖进行结构解析，并建立区域结构模型。
2.根据权利要求1所述的燕窝中硫酸乙酰肝素/肝素的提取方法与结构解析，其特征在于：步骤（1）燕窝的酶解，具体为：将燕窝研磨为粉末状，取0.1-0.2g置于20-40mL水中，常温下浸泡24-48h；再加入200μL5-10μg/μL胰蛋白酶酶液酶解燕窝；配置酶液的缓冲液为0.1-0.2MNaCl磷酸缓冲溶液，酶解条件为36-40℃，48-72h；随后取10-20mL以10000rpm离心10-20min，取上清液。
3.根据权利要求1所述的燕窝中硫酸乙酰肝素/肝素的提取方法与结构解析，其特征在于：步骤（2）阴离子交换层析提取燕窝中的糖胺聚糖，具体为：取DEAE树脂，用超纯水洗去乙醇后装柱；先向柱内加入0.2MNaCl，10-50mM磷酸缓冲液作为平衡液平衡层析柱，待柱效稳定后，加入步骤1所得上清液，随后加...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏峥，黄海月，林江慧，梁群焘，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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