一种胶原基骨软骨三层复合物及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种胶原基骨软骨三层复合物及其制备方法，所述复合物按如下方法制备：在模具中依次注入胶原-磷酸盐混合溶液，5~20mg/mL胶原水溶液和35~45mg/mL的胶原水溶液，形成致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物，将该复合物经无水乙醇、钙盐的无水乙醇溶液浸没处理后，再用EDC-NHS的MES溶液进行交联处理，获得所述胶原基骨软骨三层复合物；本发明专利技术方法提高三层支架的界面结合性能，防止骨软骨修复过程中出现层与层之间分裂的不良后果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物材料制备领域，特别涉及一种以胶原为基质材料构建结构一体化的用于骨软骨修复的胶原基骨软骨三层复合物及制备方法。
技术介绍
由于交通事故、体育运动、各种关节炎疾病引起的骨软骨损伤给病人及其家属带来了巨大的痛苦及沉重的经济负担。影响病人的生活质量，增加了社会压力。目前临床上治疗关节骨软骨病一般采用自体骨软骨移植及异体骨或异种骨软骨移植。前者来源有限且造成新的损伤点，后者存在疾病的风险。因此都不能被广泛应用。组织工程的提出使生物相容性好、具有仿生结构的生物材料逐渐应用到临床骨软 骨的治疗。然而，传统方法制备的单一结构的骨软骨修复材料已被证明不利于骨软骨的修复，而模拟骨软骨天然多层结构构建的组织工程支架材料逐渐成为研究热点，并取得较好的修复效果。但能促使有序的持久型组织再生的无细胞“智能”支架仍然停留在大量的动物实验过程中，仅有很少一部分被引入到临床实验中 o美国Smith&N印hew公司的TRUFIT plug产品为聚乙丙交酯与硫酸隹丐组成的双层活性支架，用于修复5-17mm厚的深度关节骨软骨缺损；意大利Fin-CeramicaFaenza Spa的MaioRege 产品为含不同胶原轻基磷灰石配比组成的三层骨软骨胶原结构；英国TiGENIX公司的ChondroMimetic 产品为胶原/GAG和胶原/GAG/HAp组成的双层结构用于修复关节骨软骨缺损。临床及动物实验对比中胶原基骨软骨修复材料比PLA等化学合成材料的修复效果更加明显。层与层之间的连接方式也是多层骨软骨支架的制备过程中非常关键的一步，而传统的连接工艺一般是用交联剂连接或纤维蛋白胶粘合、简单的压合、缝合、或者生物可降解聚合物的外固定，存在严重的软骨层与软骨下骨层间分离的现象。因此大量研究报道多层骨软骨界面加强的方法，例如，中国专利200710078264. 9，名为“具有仿生功能界面骨软骨复合组织一体化工程支架”，公布了一种具有足够机械强度和仿生功能界面的骨软骨复合组织，层与层之间通过钙化层的锯齿状结构连接；中国专利CN200710078392. 3，名为“一种制备含功能界面的组织工程骨软骨仿生一体化支架的方法”公布了一种通过仿生学原理和三维打印技术制备的骨软骨仿生一体化支架，应用存在广泛争议的有毒交联剂戊二醛。中国专利CN200510015576. 6，名为“一种组织工程骨软骨复合物制备方法及其应用”中用一种黏性产物将骨和软骨层连接。这些方法产生的惰性界面很可能会导致修复过程中钙化层与软骨下骨层之间分离。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种构建一体化胶原基骨软骨三层生物材料的方法，即胶原基骨软骨三层复合物，克服传统骨软骨多层结构构建过程中应用的物理及化学连接方法的缺陷。胶原基骨软骨三层复合物的一体化构建方法首先利用固态下离子扩散速率慢和物质相似相容的原理，利用胶原溶液的液、固两种形态界面融合无缝连接，然后利用乙醇与水任意比例互溶的性质，通过乙醇向胶原-水体系中的扩散将钙离子快速渗透到胶原纤维束间，同胶原分子表面的磷酸根离子反应形成原位复合的纳米羟基磷灰石，该过程具体包括如下步骤(I) 一体化致密胶原/多孔胶原/胶原-水溶性磷酸盐三层结构的低温制备。(2)钙离子单向渗透原位合成法制备一体化致密胶原/多孔胶原/胶原-纳米羟基磷灰石复合三层材料。(3)致密胶原/多孔胶原/胶原-纳米羟基磷灰石复合三层材料的一体化加强。本专利技术采用的技术方案是一种胶原基骨软骨三层复合物，所述复合物按如下方法制备(1)在模具中注入 胶原-磷酸盐混合溶液，-2(T-80°C冷冻4 24h，再注入5 20mg/mL (优选l(T20mg/mL)的胶原水溶液，0 8°C条件下静置I 15min后于-2(T-80°C冷冻4 24h，最后注入35 45mg/mL(优选40mg/mL)的胶原水溶液，0 8°C条件下静置I 15min后于-2(T-80°C冷冻4 24h，去除模具，获得致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物；所述胶原为水溶性I型胶原，所述胶原-磷酸盐混合溶液是将可溶性磷酸盐与l(T60mg/mL胶原水溶液混合配制而成，所述可溶性磷酸盐与l(T60mg/mL胶原水溶液中胶原的质量比为f 3:1 ;所述胶原-磷酸盐混合溶液、5 20mg/mL胶原水溶液与35 45mg/mL的胶原水溶液的注入体积比为2飞:2 5:1 ; (2)将步骤(I)获得的致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物迅速浸没在-2(T0°C预冷2 24h的无水乙醇a中，(TlO°C浸没反应2 10min，去除无水乙醇a后迅速放入-2(T0°C预冷2 24h的0. 05、. 5mol/L钙盐的无水乙醇溶液中，(T40°C浸没反应12 48h，去除反应液，获得致密胶原-多孔胶原-胶原纳米羟基磷灰石复合物；(3)在4 28°C、2(T40rpm (摇床振荡)条件下将步骤(2)获得的致密胶原-多孔胶原-胶原纳米羟基磷灰石复合物置于无水乙醇b中浸没2 48小时，去除无水乙醇b后加入EDC终浓度为4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液，在4 28°C、2(T40rpm摇床上振荡浸没交联2 8小时(优选2 4h)，交联结束后去除EDC-NHS的MES溶液，再用pH为7. 4 9. 0的缓冲液于4 28° C条件下浸没处理12 48h，去除缓冲液后水洗，_80°C冷冻干燥24h，获得所述胶原基骨软骨三层复合物；所述EDC-NHS的MES溶液为I-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以4 :1的质量比溶于浓度为l(T50g/L，pH=5 7. 5的2-吗啉乙磺酸(MES)的水溶液制备的蛋白交联剂溶液，所述蛋白交联剂溶液中EDC的终浓度为4mg/mL。进一步，步骤(I)所述可溶性磷酸盐为磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、磷酸一氢钠或磷酸二氢钠中的一种或两种以任意比例的混合。进一步，步骤(I)所述在模具中注入胶原-磷酸盐混合溶液、5 20mg/mL胶原水溶液与35 45mg/mL胶原水溶液的体积比为3飞2 4 :1。进一步，步骤(I)所述模具为聚四氟乙烯模具。进一步，步骤(2)所述无水乙醇a的体积用量是致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物体积的10 20倍(优选1(T15倍)。进一步，步骤(2)所述0. 05、. 5mol/L钙盐的乙醇溶液的体积用量是致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物体积的1(T20倍。进一步，步骤(2)所述钙盐的乙醇溶液为为氯化钙或硝酸钙溶于无水乙醇中制成0.05、. 5mol/L相应钙盐的无水乙醇溶液。进一步，步骤(3)所述EDC终浓度为4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液的体积用量以胶原-磷酸盐混合溶液、5 20mg/mL胶原水溶液、35 45mg/mL的胶原水溶液中胶原的总质量计为 0. I 0. 3mL/mg。进一步，步骤(3)所述缓冲液为pH值7. 4^9. 0的Tris-base缓冲液，即用IM盐酸水溶液调节浓度为6. 118g/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris-base)制成的pH值7. 4^9. 0的缓冲液。本专利技术所述EDC终浓度4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液按如下方法配制称取4gMES粉末溶于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胶原基骨软骨三层复合物，其特征在于所述复合物按如下方法制备：（1）在模具中注入胶原？磷酸盐混合溶液，？20~？80℃冷冻4~24h，再注入5~20mg/mL胶原水溶液，0~8℃条件下静置1~15min后于？20~？80℃冷冻4~24h，最后注入35~45mg/mL的胶原水溶液，0~8℃条件下中静置1~15min后于？20~？80℃冷冻4~24h，去除模具，获得致密胶原？多孔胶原？胶原水溶性磷酸盐复合物；所述胶原为水溶性Ⅰ型胶原，所述胶原？磷酸盐混合溶液是将可溶性磷酸盐与10~60mg/mL胶原水溶液混合配制而成，所述可溶性磷酸盐与10~60mg/mL胶原水溶液中胶原的质量比为1~3:1；所述胶原？磷酸盐混合溶液、5~20mg/mL胶原水溶液与35~45mg/mL的胶原水溶液的注入体积比为2~6:2~5:1；（2）将步骤（1）获得的致密胶原？多孔胶原？胶原水溶性磷酸盐复合物迅速放入？20~0℃预冷2~24h的无水乙醇a中，0~10℃浸没反应2~10min，去除无水乙醇a后迅速放入？20~0℃预冷2~24h的0.05~0.5mol/L钙盐的无水乙醇溶液中，0~40℃浸没反应12~48h，去除反应液，获得致密胶原？多孔胶原？胶原纳米羟基磷灰石复合物；（3）在4~28℃、20~40rpm条件下将步骤（2）获得的致密胶原？多孔胶原？胶原纳米羟基磷灰石复合物在无水乙醇b中浸没2~48h，去除无水乙醇b后加入EDC终浓度为4mg/mL的EDC？NHS的MES溶液，在4~28℃、20~40rpm条件下浸没2~8h进行交联，交联结束后去除EDC？NHS的MES溶液，再用pH为7.4~9.0的缓冲液于4~28℃条件下浸没处理12~48h，去除缓冲液后水洗，冷冻干燥，获得所述胶原基骨软骨三层复合物；所述EDC？NHS的MES溶液为1？乙基？3？(3？二甲基氨丙基)？碳化二亚胺和N？羟基琥珀酰亚胺以4：1的质量比溶于浓度为10~50g/L，pH=5~7.5的2？吗啉乙磺酸的水溶液制备的蛋白交联剂溶液，所述蛋白交联剂溶液中EDC的终浓度为4mg/mL。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵洪石，陈隆坤，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：浙江星月生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：