含双报告基因的菊花ACO基因过表达载体及其构建方法技术

一种含双报告基因的菊花ACO基因过表达载体，其碱基序列如SEQ ID NO.11所示，命名为PBI121‑

Overexpression vector of chrysanthemum ACO gene containing double reporter gene and its construction method

【技术实现步骤摘要】
含双报告基因的菊花ACO基因过表达载体及其构建方法
本专利技术涉及一种生物
，具体涉及一种含双报告基因的菊花ACO基因过表达载体，同时涉及该过表达载体的构建方法。
技术介绍
乙烯是一种气体激素，它的结构十分简单，能够任意出入细胞膜。对于植物生长、发育有重要作用。该激素能调节植物器官的老化与脱落，还能促进果实的成熟，并且在逆境胁迫和病原菌侵染条件下，植物中的乙烯合成量会增加，将植物自身的防卫反应激活，可见乙烯是植物逆境胁迫中的重要激素。ACC氧化酶(ACCoxidase,ACO)，又称乙烯合成酶(ethylene-formingenzyme,EFE)，是催化乙烯生物合成途径的最后一步(即催化ACC生成乙烯)的关键酶，控制着乙烯的生成速率。近年来的研究表明，ACO基因家族的特异表达，不论是在果实成熟和花器官发育过程，还是在植物营养器官的生长发育过程，对乙烯生物合成的调节都是十分重要的，如：Picton等应用反义RNA技术转移ACO基因，转基因番茄植株果实中乙烯比对照组下降了90％，在转色期采收的果实3个星期才能变红，而对照组只用7d，并且转基因果实一旦变红后，并不像正常果实过熟那么快，在室温条件下可放130d。Ayub等将反ACC氧化酶基因转入甜瓜中，也获得了与番茄类似的结果，果实中乙烯合成减少99.5％，成熟明显被推迟，果实表现出较好的抗性和耐储性。Savin等利用ACC氧化酶基因的反义RNA技术抑制康乃馨乙烯释放，从而延缓花瓣的衰老取得成功。此外，植物中有时还需要提高乙烯的含量，一个ACO的过表达构建是最合适的。如：在红花中，ACO1过表达可刺激类黄酮的生物合成途径，对油籽的生产具有重要意义。ACO1在杨树中过表达会刺激形成层细胞分裂，进而导致木质部发育增加，抑制伸长生长，这是木材行业的理想特性。ACO基因是高度保守的，金勇丰等采用PCR和RT-PCR技术成功地从“玉露”桃基因组DNA、成熟果实、叶片伤诱导cDNA中扩增克隆出ACC氧化酶基因，该基因全长1288bp，编码319氨基酸，与番茄ACC氧化酶基因eth1、矮牵牛ACO1、康乃馨pSR120氨基酸序列同源性分别为83％、76.8％、74％。因此，ACO基因在不同物种中可能具有相似的功能。绿色荧光蛋白(Gfp)基因和葡萄糖醛酸糖苷酶(Gus)基因是植物分子生物学研究最为常用的2个报告基因，广泛应用于转基因、启动子分析以及基因表达调控研究。它们在使用上各有特点，在定性和定量研究基因表达和启动子功能等方面各有优劣。报告基因的选择取决于实验研究目的、性质以及分析方法上的可行性，但单个报告基因往往存在不足，植物分子生物学目前已重视多个报告基因的联合使用。如，GUS一般用来做植物组织定位，比如说根、茎、叶部位；GFP可以用来做亚细胞定位，通过共聚焦显微镜可以观察基因在细胞内哪些位置表达，比如说定位在线粒体、叶绿体、或者核内等等。为建立一个简单快速、可定性定量检测植物启动子活性的报告基因表达系统，融合GUS::GFP报告基因在不同植物中高效表达，其融合蛋白同时具有荧光特征和组织化学底物特征，弥补了单个GUS或GFP报告基因在研究应用上的缺陷。高效的多报告基因联用系统，可以整合不同报告基因手段的优势，获得更多生物信息量，在植物基因工程的研究中可实现较高的外植体再生和转化频率。GFP报告基因与GUS报告基因联合使用就具有实时性、非侵入性、可靠易检测、可重复、高敏感度，且可用于大规模检测。孔德真等构建了含有GFP-GUS融合基因的真菌表达载体，并通过农杆菌介导转入两株致病性不同的非落叶型黄萎病菌，阳性转化子的孢子和菌丝，通过GUS组织化学染色，都能表现出蓝色，表明GUS-GFP融合基因成功的整合到新疆棉花黄萎病菌的基因组中，并能稳定的遗传表达。GFP与GUS双元标记使用还可以促进基因的实时监测，背景蛋白表达相对稳定，监测背景的表达量增多；此外植株报告基因灵敏度增加，信号产生的时间缩短，检测方法多样，检测费用经济实惠等优点，使GFP与GUS双元标记在植物分子生物学应用上具有广阔的前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种含双报告基因的菊花ACO基因过表达载体及其构建方法。为达上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种含双报告基因的菊花ACO基因过表达载体，其碱基序列如SEQIDNO.11所示，命名为PBI121-CmACO-GFP。本专利技术同时提供上述含双报告基因的菊花ACO基因过表达载体的构建方法，该方法步骤如下，结合参见图1：(1)pBI121-GFP质粒的构建：获取表达载体pCAMBIA1304中报告基因GFP片段；将pBI121质粒双酶切、纯化后，与纯化的GFP片段进行连接；(2)通过CmACO基因的同源克隆，获取CmACO基因的全长cDNA序列，再获取CmACO基因ORF区全长序列；(3)构建pBI121-CmACO-GFP载体：获取CmACO基因全长ORF片段，将pBI121-GFP质粒进行单酶切、纯化后，与纯化的CmACO基因全长ORF片段进行连接。具体地，pBI121-GFP质粒的构建时，利用如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物序列，PCR扩增得GFP片段，其中，扩增反应体系为：5×PrimeSTARBuffer4μl、2.5mMdNTPs1.5μl、cDNA1μl、10mMGFPXF1μl、10mMGFPBR1μl、PrimeSTARHSDNAPolymerase0.2μl、ddH2O补至20μl；反应条件为：(98℃10s，56℃10s，72℃2min)35个循环，72℃7min。并采用BamHI酶和XbaI酶对pBI121质粒进行双酶切；最后将纯化的GFP片段与pBI121质粒进行连接，连接反应体系为：5×In-FusionHDEnzymePremix2μl、pBI121线性质粒50-200ng、GFP片段50-100ng、ddH2O补至10μl。CmACO基因的同源克隆时所用引物序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。pBI121-CmACO-GFP载体构建时，利用如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示的引物序列PCR扩增获得获取CmACO基因全长ORF片段，其中，扩增反应体系为：5×PrimeSTARBuffer4μl、dNTPs(2.5mM)1.5μl、cDNA1μl、ACOXF(10mM)1μl、ACOXR(10mM)1μl、PrimeSTARHSDNAPolymerase0.2μl、ddH2O补至20μl；反应条件为：(98℃10s，62℃10s，72℃2min)35个循环，72℃7min；采用XbaI酶对pBI121-GFP质粒进行单酶切；最后将纯化的CmACO基因全长ORF片段和pBI121-GFP质粒进行连接，连接时的反应体系为：5×In-FusionHDEnzymePremix2μl、pBI121-GFP线性质粒50-200ng、CmACO片段50-100ng、ddH2O补至10μl。本专利技术的含双报告基因的菊花ACO基因过表达载本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含双报告基因的菊花ACO基因过表达载体，其碱基序列如SEQ ID NO.11所示，命名为PBI121-CmACO-GFP。/n

【技术特征摘要】
1.一种含双报告基因的菊花ACO基因过表达载体，其碱基序列如SEQIDNO.11所示，命名为PBI121-CmACO-GFP。


2.权利要求1所述载体的构建方法，其中，该方法步骤如下：
(1)pBI121-GFP质粒的构建：获取表达载体pCAMBIA1304中报告基因GFP片段；将pBI121质粒双酶切、纯化后，与纯化的GFP片段进行连接；
(2)通过CmACO基因的同源克隆，获取CmACO基因的全长cDNA序列和CmACO基因ORF区全长序列；
(3)构建pBI121-CmACO-GFP载体：获取CmACO基因全长ORF片段，将pBI121-GFP质粒进行单酶切、纯化后，与纯化的CmACO基因全长ORF片段进行连接。


3.如权利要求2所述的构建方法，其中，所述步骤(1)获取GFP片段时所用引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。


4.如权利要求2所述的构建方法，其中，所述步骤(1)中获取GFP片段时PCR扩增反应体系为：5×PrimeSTARBuffer4μl、2.5mMdNTPs1.5μl、cDNA1μl、10mMGFPXF1μl、10mMGFPBR1μl、PrimeSTARHSDNAPolymerase0.2μl、ddH2O补至20μl；反应条件为：(98℃10s，56℃10s，72℃2min)35个循环，72℃7min。


5.如权利要求2所述的构建方法，其中，所述步骤(1)采用BamHI酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩成云，雍成文，赵志刚，支添添，
申请(专利权)人：宜春学院，
类型：发明
国别省市：江西;36