KNAT1基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用制造技术

本发明专利技术提供了

Application of knat1 gene in improving salt stress resistance of plants

【技术实现步骤摘要】
KNAT1基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用
本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及KNAT1基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用。
技术介绍
盐胁迫是影响农作物产量的非生物胁迫因子之一，主要因为在农作物种植过程中，大面积的盐碱地和盐渍化土壤会使部分农作物品种受到不同程度的盐害影响，进而难以发挥出农作物自身的产量潜力。而植物的抗盐性是一个由多基因决定的复杂的数量性状，且不同植物的耐盐方式和耐盐机理是存在区别的，其组织或细胞的耐盐反应也均有不同。随着耕地面积不断地减少以及人口不断地增长，为了农作物具有更高的产量和性状，研究农作物的耐盐机理、培育耐盐农作物品种对开发和有效利用盐碱地或盐渍化土壤具有重要的现实意义。同源异型盒基因（homeoboxgenes）是一类广泛存在于动植物和酵母中高度保守的DNA序列，用于编码转录调控因子（同源异型盒蛋白），在细胞增殖分化中起着精密的调节作用。最早的同源异型盒基因在果蝇中被发现，但研究者第一次从植物中分离出来的同源异型盒基因是KNOTTED1（KN1或ZmKN1），它是从玉米（Zeamays）功能获得性突变体中得到的，而该突变体可以使玉米叶脉附近形成手指状突起结构。自此以后，人们陆续从拟南芥、水稻、大麦、番茄等植物中克隆到大量类似于ZmKN1的基因，并将这些基因形成一个家族，称之为KNOX家族。根据基因核苷酸序列及其所编码蛋白质同源结构域中氨基酸序列的相似性、表达模式的不同，研究者将KNOX分为两类亚家族：I类KNOX亚家族（KNOXI）和II类KNOX亚家族（KNOXII）。两类亚家族成员之间具有比较大的结构差异性，且每个亚家族内的蛋白质结构都具有高度的保守性。KNAT1基因属于KNOXI亚家族，该基因与拟南芥调控发育及形态相关，比如可以调控拟南芥果荚与花序茎的夹角，其CDS长度为1197bp，编码含有399个氨基酸的转录因子。在现有研究中，KNOXI亚家族可以在植物的分生组织中表达，是分生组织发生与维持所必需的关键基因，还可以调控与器官发生相关的细胞分化，进而影响侧生器官的形态建成，其单基因突变表现出较为强烈的发育及形态上的变化。但至今，有关KNAT1基因在植物非生物胁迫中的功能及作用的相关报道却尚未发现。
技术实现思路
针对上述现有技术的情况，本专利技术的目的在于提供了KNAT1基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用，本专利技术通过KNAT1基因获得KNAT1基因超表达载体pBI121-KNAT1，并进而获得了KNAT1基因超表达纯合株系，所述超表达株系具有很好的盐胁迫抗性。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供了KNAT1基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用。进一步的，所述应用的方法为：将含有所述KNAT1基因的超表达载体通过花絮侵染法转化到植物中而获得具有盐胁迫抗性的植物。进一步的，所述超表达载体为pBI121-KNAT1。进一步的，含有所述KNAT1基因的植物超表达纯合株系在盐胁迫下的种子萌发率明显高于野生型株系及突变体。进一步的，含有所述KNAT1基因的植物超表达纯合株系在盐胁迫下的子叶展开率明显高于野生型株系及突变体。进一步的，含有所述KNAT1基因的植物超表达纯合株系在盐胁迫下的成苗存活率明显高于野生型株系及突变体。进一步的，所述植物为拟南芥。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：本专利技术通过基因工程技术获得了KNAT1基因的超表达载体pBI121-KNAT1，并通过筛选获得了KNAT1基因超表达纯合株系，在盐胁迫下，这些株系具有明显的提高植物盐胁迫抗性的能力，进而能够增加植物种子的萌发数量和速度、缩短子叶展开的时间，提高成苗期株系的存活率。本专利技术通过实验首次确认了KNAT1基因可以提高拟南芥的盐胁迫性，并鉴于KNAT1基因在盐胁迫中的应用，可以认为该基因对提高植物盐胁迫性具有潜在的应用价值，同时本专利技术也为利用KNAT1基因培育耐盐、高产的农作物品种奠定良好的理论和应用基础。附图说明图1为本专利技术的KNAT1基因的核苷酸序列和氨基酸序列。图2为本专利技术的KNAT1基因超表达纯合株系表达量的检测电泳图。图3为本专利技术的野生型WT、KNAT1基因突变株knat1-11和knat1-12及KNAT1基因超表达纯合株系OE-18和OE-19的种子萌发及子叶展开结果；其中图3A：上述株系在正常条件（CK）及盐胁迫下的种子萌发及子叶展开表型；图3B：萌发率统计结果；图3C：子叶展开率统计结果。图4为本专利技术的野生型WT、KNAT1基因突变株knat1-11和knat1-12及KNAT1基因超表达纯合株系OE-18和OE-19成苗存活率结果；其中图4A：上述株系在正常条件（CK）及盐胁迫下的成苗表型；图4B：存活率统计结果。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步详细的说明。以下实验中用到的试剂购自TAKARA、Sigma等生物公司；蛭石培养基质和营养液也均为市售产品。实施例1：KNAT1基因突变体和超表达纯合株系的获得在拟南芥TAIR数据库中获得KNAT1基因的CDS序列，其长度为1197bp，编码含有399个氨基酸的蛋白质，该基因的核苷酸和氨基酸系列如图1所示。一、KNAT1基因突变体株系的获得KNAT1基因X-射线诱变突变体knat1-11通过拟南芥生物资源中心（ABRC）获得；KNAT1基因突变体knat1-12经甲基磺酸乙酯（EMS）诱变获得，具体为使用0.5%EMS浸泡拟南芥种子12h后再对其进行纯合体筛选、表达、分析并最终进行鉴定，鉴定结果显示EMS诱变成功，获得拟南芥knat1-12突变体，而在突变体中KNAT1基因几乎无表达。二、KNAT1基因超表达纯合株系的获得1、KNAT1基因超表达株系的获得（1）根据上述获得的KNAT1基因的序列，设计基因特异引物，其序列如下：KNAT1-F:5’-ATGGAAGAATACCAGCATGACAACAGC-3’（SEQIDNo:1）KNAT1-R:5’-TGGACCGAGACGATAAGGTC-3’（SEQIDNo:2）通过PCR技术扩增KNAT1基因，并将其扩增产物进行回收、纯化后克隆到pMD18-TSimple克隆载体上，获得pMD18-T-KNAT1重组质粒，经测序确认后，使用限制性内切酶BamHI与SacI对pMD18-T-KNAT1重组质粒和pBI121质粒进行双酶切，将KNAT1基因连接到pBI121中35S启动子后面获得超表达载体pBI121-KNAT1。（2）将步骤（1）得到的超表达载体pBI121-KNAT1转化至农杆菌GV3101中，并利用花絮侵染法（将农杆菌重悬于含有5%蔗糖溶液和0.1%的表面活性剂SilwetL-77的侵染液中，选择盛开的拟南芥花絮，浸入侵染液中10秒，在暗箱中培养24小时后，将侵染过的拟南芥置于正常光照条件下培养）获本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.

【技术特征摘要】
1.KNAT1基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用。


2.根据权利要求1所述的KNAT1基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述应用的方法为：将含有所述KNAT1基因的超表达载体通过花絮侵染法转化到植物中而获得具有盐胁迫抗性的植物。


3.根据权利要求2所述的KNAT1基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述超表达载体为pBI121-KNAT1。


4.根据权利要求1所述的KNAT1基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用，其特征在于，含有所述KNAT1基因的植物超表达纯合株系在盐胁...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄金光，蔡慧娴，郑成超，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37