【技术实现步骤摘要】
一种菊花CmSVP基因的应用
本专利技术属于植物基因工程领域，特别涉及一种菊花CmSVP基因的应用。
技术介绍
“耐寒惟有东篱菊，金粟初开晓更清”，菊花作为我国的传统名花，历来悠久，被视为孤标亮节、高雅傲霜的象征。菊花品种繁多，可用于插花、盆栽、药材等，具有很高的观赏价值和药用价值，而花期问题是影响人们追求四季赏菊最重要的限制因素。菊花的花期主要受温度，光照条件的影响。大部分菊花品种属于典型的短日照植物，需要经过一定时数的短日照才可以进入花芽分化阶段，这极大地限制了其观赏及应用，菊花的四季开放一直是育种学家们的目标。SVP（SHORTVEGETATIVEPHASE）基因是MADS-box家族STMADS11亚家族中重要的开花负调控因子，其同源基因广泛存在于各种植物中，现已在多种草本、木本植物中均克隆得到SVP同源基因。SVP主要在营养器官表达，不同物种的SVP基因表达模式相似，而同一物种中同源基因表达呈现多样性。SVP基因作为开花抑制因子，参与自主途径、GA途径及温敏途径，其表达水平直接导致开花时间的改变。同时SVP基因和AP1、AGL24通过功能冗余调控花分生组织特异性和抑制B类，C类和E类基因的表达，从而影响植株花发育，花序建成。近年来，SVP基因在植物开花响应机制被广泛研究，特别是对温度敏感性的植物。大量的研究表明SVP及其同源基因在不同植物的表达模式及其功能不尽相同。目前菊花CmSVP基因已成功分离并在拟南芥中验证其抑制拟南芥开花并影响其花序发育，该成果已于2017年发表（GaoYaohui,...
【技术保护点】
1.一种菊花
【技术特征摘要】
1.一种菊花CmSVP基因的应用，其特征在于包含以下步骤：
步骤1：将菊花‘粉地毯’作为转基因研究受体材料，通过茎段无菌扩繁，培养条件为长日照（16h光照/8h黑暗），温度为23-25℃；
步骤2：CmSVP基因的获得：根据已获得的转录组数据的CmSVP全长序列，设计CmSVP基因的特异性引物；按照如下体系进行PCR扩增：1μlcDNA模板，
上游引物CmSVP-F（5’-ATGATGGTTAGGGAGAAAGTGC-3’）
下游引物CmSVP-R（5’-TCAACCTGAGTATGGTAATCCTAAC-3’）(10μmol·L−1)，12.5μlPCRMIX，ddH2O补足至25μl，反应程序为94℃5min，94℃30s，58℃1min，72℃for30s，35个循环，72℃10min，然后4℃保存；将电泳检测后的目的条带切胶回收纯化；回收后的DNA连接pEASY-Blunt载体，并转化大肠杆菌感受态，挑取6个单克隆测序，获得pEASY-Blunt-CmSVP；
测序后的序列通过NCBI网站的Blast程序进行基因比对，利用ORFfinder预测菊花CmSVP基因的ORF区及推测的氨基酸序列；利用Expasy在线分析软件分析菊花CmSVP蛋白的理化性质；从GenBank上下载多个物种的SVP同源基因蛋白序列，用ClustalW进行不同植物物种间蛋白的多序列同源比对，并分析菊花CmSVP蛋白的保守位点；利用MEGA6.0软件构建不同植物SVP蛋白的系统发育进化树；
步骤3:植物表达载体的构建,其中pCAMBIA-1304-CmSVP植物表达载体的构建如下：
根据CmSVP基因序列设计PCR引物，分别在上游及下游引物的5’端引入NcoI和BstEII酶切位点，以pEASY-Blunt-CmSVP质粒为模板，利用高保真Taq酶，
上游引物CmSVP-NcoI-F（CATGCCATGGATGATGGTTAGGGAGAAAGT）
下游引物CmSVP-BstEII-R（GGGTATACCTCAACCTGAGTATGGTAATC）
进行PCR扩增，反应程序为98℃2min，98℃30s，68℃6min30s，35循环，4℃保存；
将扩增后的PCR产物经电泳检测后切胶回收纯化，连接pEASY-Blunt载体,连接产物转化大肠杆菌并经过蓝白斑筛选，挑取单克隆测序，测序正确的菌液质粒命名为pEASY-CmSVP；
按照如下体系对上述获得的菌液质粒进行双酶切：20μlpCAMBIA-1304（pEASY-CmSVP质粒），2.5μlNcoI，2.5μlBstEII，5μlCutsmart，20μlddH2O；然后回收酶切后的pEASYCmSVP小片段及pCAMBIA-1304的大片段，并按照如下体系进行连接：pCAMBIA-1304大片段1μl，pEASY-CmSVP小片段7.5μl，T4DNA连接酶0.5μl，T4ligasebuffer1μl，37℃连接过夜；
连接产物转化大肠杆菌感受态：挑取单克隆进行菌液PCR验证；选取有目的条带的菌液测序，测序正确的命名为pCAMBIA-1304-CmSVP质粒，并对其通过冻融法转化农杆菌感受态；
步骤4:CmSVP基因在菊花中的遗传转化：
对地被菊‘粉地毯’进行遗传转化，利用以pmi为安全标记的菊花遗传转化体系进行实施，并根据实验调整筛选标记及浓度，以潮霉素为筛选标记的地被菊‘粉地毯’叶盘转化的基本培养基配方如下：
M1培养基：MS培养基+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，PH5.8-6.0
M2培养基：M1培养基+400mg/LCar，PH5.8-6.0
M3培养基：M2培养基+4mg/LHyg，PH5.8-6.0
M4培养基：M1培养基+300mg/LCar+6mg/LHyg，PH5.8-6.0
M5培养基：MS培养基+4mg/LHyg，PH5.8-6.0；
在上述培养基内进行培养使其长成...
【专利技术属性】
技术研发人员：高耀辉，马明，魏光普，马斌，肖凤语，
申请(专利权)人：内蒙古科技大学，
类型：发明
国别省市：内蒙;15
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