一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法，首先提取植物组织中总RNA；通过反转录PCR合成PCR反应模板；构建用于敲除对应基因的重组表达载体作为敲除载体；通过农杆菌介导的毛状根转化法转化受体植物，以下调受体植物中对应基因的表达，增加受体植物根系的结瘤数目。利用本发明专利技术构建的重组表达载体转化受体大豆植株获得转基因植物，能够显著提高大豆根系的根瘤数目。

【技术实现步骤摘要】
一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法
本专利技术涉及基因工程
，尤其是一种培育具有高结瘤能力的植物的方法。
技术介绍
大豆是重要的粮油经济作物，其通过根瘤可将空气中的氮气转化为可被植物吸收利用的氨态氮，从而为大豆生长发育提供了必需的氮素营养。由根瘤介导的共生固氮过程不仅影响着大豆的正常生长和产量，还有利于节约能源，减少环境化学污染。目前，提高共生固氮效率已成为提高大豆产量及保证农业可持续发展的重要途径之一，而在分子层面了解大豆的结瘤和根瘤发生发育的分子机制是更加合理利用大豆高结瘤固氮效率这一特点的重要基础。植物激素参与豆科根瘤的形成和发育过程，这其中细胞分裂素（Cytokinin）在调节根瘤发育中起关键作用（FergusonandMathesius，2014）。在豆科植物中，可以通过外源施用细胞分裂素诱导根瘤状的结构的发生（Mathesiusetal.,2000;Heckmannetal.,2011）。在蒺藜苜蓿中过表达LOG基因（细胞分裂素核苷5'-单磷酸磷酸水解酶）使得根瘤的数目减少（Mortieretal.,2014），异戊烯基转移酶（IPTs）是细胞分裂素生物合成的关键组分，在百脉根中叶片中由根瘤菌侵染诱导的LjIPT3可以促进细胞分裂素的合成并向地下运输来实现对二次结瘤的抑制（Sasakietal.,2014）；除此之外，由根瘤菌侵染诱导的细胞分裂素氧化酶/脱氢酶基因（CKX）在根瘤原基和发育的根瘤中表达，蒺藜苜蓿中的ckx3突变体中细胞分裂素含量显着增加并抑制根瘤的发生，表明适量的细胞分裂素对豆科植物的结瘤特别重要（Dugaldetal.,2016）。百脉根细胞分裂素受体的功能获得型突变能够产生自发结瘤（Gonzalez-Rizzoetal.,2006），而苜蓿和百脉根中的细胞分裂素受体突变体cre1和lhk1丧失了形成根瘤原基的能力。响应调节因子（RR）是细胞分裂素信号传导的下游关键组分，这其中A响应调节因子是细胞分裂素信号通路中的负调节因子，包括ARR3-ARR9和ARR15-ARR17，它们只有10个受体结构域和短C末端；而B型反应调节因子是细胞分裂素信号通路中的正调节因子，包括ARR1，ARR2，ARR10-ARR14，ARR18-ARR21，其具有11个信号接受结构域、C末端DNA结合结构域和转录激活结构域，它们可以直接调节下游靶基因并激活A型反应调节因子的表达（Jenniferetal.,2008）。而关于RR在调控大豆结瘤中的作用，目前尚未见到。有关B型的响应因子RR11在大豆根系结瘤和共生固氮中是否有调控作用还没有报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案如下。一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法，通过在植物中下调表达序列表中SEQIDNO：1所示的基因片段或其同源基因，以增加受体植物根系的结瘤数目。作为本专利技术的一种优选技术方案，构建敲除载体并转化受体植物，以下调受体植物中对应基因的表达，增加受体植物根系的结瘤数目。作为本专利技术的一种优选技术方案，操作步骤包括：A、首先提取植物组织中总RNA；B、通过反转录PCR合成PCR反应模板；C、构建用于敲除对应基因的重组表达载体作为敲除载体；D、通过农杆菌介导的毛状根转化法转化受体植物，以下调受体植物中对应基因的表达，增加受体植物根系的结瘤数目。作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤C中所述敲除载体的骨架载体为pB7GWIW2载体。作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤C中所述敲除载体的构建步骤包括：C-1、构建含有目的基因序列的pDONR207载体质粒；C-2、通过LR反应构建目标敲除载体。作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤C-1的操作过程为：利用步骤B中反转录得到的植物cDNA为模板进行PCR，扩增目的基因片段；其中，扩增所用的正向引物序列如序列表中SEQIDNO：2所示；反向引物如序列表中SEQIDNO：3所示；扩增程序为：95℃5min；95℃30sec，56℃30sec，68℃1.5min，30个循环；72℃70sec；PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化1500bp附近的条带；回收的DNA片段与载体pDONR207连接，5μl体系中加入pDONR207vector1μl，回收片段3μl，BP酶1μl混匀混合液，25℃连接过夜，热击法转入E.coli大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，挑阳性克隆并测序。作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤C-2的操作过程为：提取步骤C-1中得到的含有正确测序的pDONR207载体质粒，然后通过LR反应连接到pB7GWIW2骨架载体，连接产物热激转化感受态大肠杆菌DH5α菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序，得到目标重组表达载体。作为本专利技术的一种优选技术方案，所述受体植物为蝶形花科植物。本专利技术的技术创新还包含一种具有负向调控功能的重组表达载体，包含pB7GWIW2骨架载体和序列表中SEQIDNO：1所示的基因片段。本专利技术的技术创新还包含具有上述重组表达载体的转化体和植物受体。采用上述技术方案所产生的有益效果在于：参见下述的实施例3，利用本专利技术构建的重组表达载体（敲除载体）转化受体大豆植株获得转基因植物，能够显著提高大豆根系的根瘤数目。附图说明图1为实施例中，目的基因在根、叶和瘤中的表达模式（图1A）以及在响应长期根瘤菌侵染的表达模式分析（图1B）。可见该基因主要在根瘤中表达，且在根瘤菌侵染后的大豆根中，目的基因的表达受到显著诱导，该结果说明目的基因参与了大豆根系结瘤固氮的过程。图2为实施例2-3中，过表达和敲除GmRR11L1后对大豆结瘤的表型分析，在完全相同的实验环境下，上调表达GmRR11L1的转基因根同空载体转化的转基因根系(EV)相比，根瘤数量显著减少(图2A-2C)，图2A为对转基因根系中GmRR11L1的表达水平分析，结果显示在转基因根系中GmRR11L1的表达是显著上调的；下调表达GmRR11L1的转基因根同空载体转化的转基因根系(EV)相比，根瘤数量显著减少(图2D-2F)，图2D为对转基因根系中GmRR11L1的表达水平分析，结果显示在转基因根系中GmRR11L1的表达是显著下调的。具体实施方式以下实施例详细说明了本专利技术。本专利技术所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。下述实施例中的百分比（%），如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，如无特别说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、目的基因的组织表达模式以及其在响应根瘤菌处理的表达模式分析。1）材料获取：实验所用材料为威廉姆斯82（W82）；材料按照以下本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法，其特征在于：通过在植物中下调表达序列表中SEQ ID NO：1所示的基因片段或其同源基因，以增加受体植物根系的结瘤数目。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法，其特征在于：通过在植物中下调表达序列表中SEQIDNO：1所示的基因片段或其同源基因，以增加受体植物根系的结瘤数目。


2.根据权利要求1所述的一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法，其特征在于：构建敲除载体并转化受体植物，以下调受体植物中对应基因的表达，增加受体植物根系的结瘤数目。


3.根据权利要求2所述的一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法，其特征在于：操作步骤包括：A、首先提取植物组织中总RNA；B、通过反转录PCR合成PCR反应模板；C、构建用于敲除对应基因的重组表达载体作为敲除载体；D、通过农杆菌介导的毛状根转化法转化受体植物，以下调受体植物中对应基因的表达，增加受体植物根系的结瘤数目。


4.根据权利要求3所述的一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法，其特征在于：步骤C中所述敲除载体的骨架载体为pB7GWIW2载体。


5.根据权利要求4所述的一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法，其特征在于：步骤C中所述敲除载体的构建步骤包括：C-1、构建含有目的基因序列的pDONR207载体质粒；C-2、通过LR反应构建目标敲除载体。


6.根据权利要求5所述的一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法，其特征在于：步骤C-1的操作过程为：利用步骤B中反转录得到的植物cDNA为模...

【专利技术属性】
技术研发人员：李霞，王利祥，胡阳阳，陈嘉欢，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42