一种基于野生种质的优质棉花材料创制方法技术

本发明专利技术属于调节基因表达的非编码核酸，如反义寡核苷酸技术领域，公开了一种基于野生种质的优质棉花材料创制方法，所述基于野生种质的优质棉花材料创制方法具体包括：提取野生种质的优质棉花材料DNA；采用基因芯片筛选优质棉花材料相关优质或抗性基因；将筛选的优质或抗性基因进行PCR扩增基因片段；采用农杆菌转化法将扩增之后获得的基因片段导入现有优质棉花细胞内，并将其培育成一个完整的植株；对得到的植株采用线束法进行自交得到F1代棉花；将F1代棉花与母本进行回交得到F2代棉花，将F2代棉花与母本棉花再次回交得到F3代棉花，然后，通过自交纯合获得优质棉花材料。本发明专利技术能够充分利用野生种质的棉花优良基因。

A method of creating high quality cotton materials based on Wild Germplasm

【技术实现步骤摘要】
一种基于野生种质的优质棉花材料创制方法
本专利技术属于调节基因表达的非编码核酸，如反义寡核苷酸
，尤其涉及一种基于野生种质的优质棉花材料创制方法。
技术介绍
我国是世界上最大的产棉国和消费国。促进棉花生产可持续发展，是保障我国棉花产业安全客观和现实的要求。我国原棉供需矛盾突出，常年缺口达400万吨，已是仅次于大豆的第二大进口农产品。人多地少和必须确保粮食安全的基本国情，决定了棉花产业可持续发展的策略，必须是在提高棉花纤维品质的同时，注重挖掘单产潜力、走内涵的扩大再生产的道路。种质是育种的物质基础，棉花遗传改良的潜力取决于种质资源。是否拥有丰富的种质基因库，是决定育种工作成败的关键因素之一。我国栽培种植的棉花中，陆地棉占90％以上。从起源上看，栽培陆地棉原始种都源于墨西哥引入的一个家系的12个单株。在人工选育进程中，尽管不断引入外来种质，但是陆地棉遗传基础较为狭窄的局面并未从根本上改观。据统计，自1890年至1995年育成陆地棉品种1291个，其中具有岱字棉、斯字棉、柯字棉及其后裔血缘的分别为530、189、25个，而岱字棉、斯字棉、柯字棉有着共同祖先，即其中744个(占57.63％)具有相同的血缘(周盛汉1995)；早熟品种有95.2％具有金字棉种质(王道均等1980)；抗枯萎病品种有204个，其中来自52-128、岱字棉15、乌干达和亚洲棉(中棉)血缘的186个(冯纯大等1996)。据统计，陆地棉品种种植面积2万公顷以上的有59个，亲本有美棉血缘的占72.2％。这些事实说明，在棉花品种改良中骨干亲本作用十分重要，同时，也反应出我国现有陆地棉品种遗传基础狭窄、种质贫乏。缺乏优异的种质资源，是制约我国棉花产量提高、品质改良的关键因素。由于在棉花的栽培驯化过程中，选择目标过于单一，许多优良基因和对逆境条件的抗性逐步丧失。现有陆地棉以岱字棉、斯字棉等血统居多，抗源遗传基础相当狭窄——从1892年引进陆地棉至1996年，我国育成204个抗枯萎病品种，有川52－128、岱字15、中棉所和乌干达棉血缘的品种就达186个。尽管棉属种的起源地区一些野生种、半野生种蕴藏着许多优良基因，由于远缘杂交存在的杂交不亲和、杂种不孕不育及后代疯狂分离等困难，筛选新品种所需时间较长，且目标性状易丢失，所以种间以上的远缘杂交直接育成生产品种难度较大，这些野生优异基因资源的有效利用依旧是当前和今后研究的热点和难点。其中，墨西哥野生棉(Gossypiumhirsutumspp.mexican)是陆地棉的半野生种，分类上应该划归陆地棉的野生种系，蕴藏着优质纤维及抗枯黄萎病、抗高温干旱、抗涝耐渍等许多优良基因。近年来，我国在耕地面积只减不增的情况下，一些地方出现了粮、棉、菜等作物相互争地的现象。虽然棉花为我国新疆、黄河流域等棉花产区带来了可观的利润。但有限的耕地资源是这些地区进一步扩大生产棉花的主要瓶颈。现有的棉花品种具备一定的缺陷性，而野生的棉花品种有的能够弥补这些缺陷。综上所述，现有技术存在的问题是：现有棉花品种具备一定缺陷性，抗性不强；而现有棉花的创制与培育均基于抗性基因，不能很好的利用野生棉花种质的优良基因。解决上述技术问题的难度：尽管棉属种的起源地区一些野生种、半野生种蕴藏着许多优良基因，由于远缘杂交存在的杂交不亲和、杂种不孕不育及后代疯狂分离等困难，筛选新品种所需时间较长，且目标性状易丢失，所以种间以上的远缘杂交直接育成生产品种难度较大。解决上述技术问题的意义：本专利技术通过利用墨西哥野生棉优良基因，育成中间品系材料鄂9011(鄂9011生长势强，籽指高，籽棉单产高，抗病、抗高温干旱、抗涝耐渍，长衣份(大于31mm)高比强(大于32cN/tex)但衣分偏低、马克隆值偏高)；再利用鄂9011以及组选育的鄂抗棉5号、5712、ZA02、ZS1108等优质材料，成功育成一系列通过湖北省审定的棉花新品种——鄂抗棉12、优质早熟抗虫常规棉ZD2040、优质抗虫杂交棉Qs01、Qs05等。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种基于野生种质的优质棉花材料创制方法。本专利技术是这样实现的，一种基于野生种质的优质棉花材料创制方法，所述基于野生种质的优质棉花材料创制方法具体包括：步骤一，提取野生种质的优质棉花材料DNA；步骤二，采用基因芯片筛选优质棉花材料相关优质或抗性基因；步骤三，将筛选的优质或抗性基因进行PCR扩增基因片段；步骤四，采用农杆菌转化法将扩增之后获得的基因片段导入现有优质棉花细胞内，并将其培育成一个完整的植株；步骤五，对得到的植株采用线束法进行自交得到F1代棉花；步骤六，将F1代棉花与母本进行回交得到F2代棉花，将F2代棉花与母本棉花再次回交得到F3代棉花，然后，通过自交纯合获得优质棉花材料。进一步，步骤一中，所述DNA提取方法具体包括：(1)取1个3mm钢珠放入2mL离心管中，取野生棉花的新鲜叶片放入管中钢珠上面，再在棉花叶片上面放1个3mm钢珠，盖上离心管盖子；(2)将离心管放入液氮中冷冻3min，取出放置在涡旋仪上振荡粉碎；(3)待离心管中的叶片呈碎末状，加入定量预热(60℃)的DNA抽提缓冲液，置于60℃水浴30min；(4)顺着离心管侧壁，用磁铁吸出钢珠；(5)加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1的混合液，轻轻混匀；并在4℃12000r/min离心10min；(6)将上清液移至新的1.5mL离心管中，加入1μLRNase(1mg/mL)，37℃下水浴30min；(7)加2/3体积的异丙醇，轻轻摇匀，于－20℃条件下静置2～3h；(8)取出样品，12000r/min离心10min，弃去上清液；(9)加入500μL70％乙醇，轻柔洗涤，4000r/min离心5min，弃去上清液；重复3次；(10)真空抽干DNA样品，加入200μLddH2O充分溶解，于-20℃备用。进一步，步骤二中，所述利用基因芯片筛选优质或抗性基因的方法包括以下步骤：第一步，DNA微阵列制备：自行设计、制备探针并点样固定；第二步，实验样本准备：包括待测样本的核酸提取与纯化、生物大分子的标记与纯化；第三步，将生物大分子与芯片进行杂交反应；第四步，信号检测与数据分析：利用partek软件对芯片扫描得到的数据进行方差及平均值的计算和处理，得到芯片比对的数据和聚类分析图；使用MASS方法进行数据的均一化。进一步，第四步中，所述信号检测分析包括：1)根据检测到的杂交信号，算出检测P-value值；2)通过每个探针组对PM/MM探针信号值进行统计学计算得出一个显著性的P-value；3)通过t检验域值确定P-value的上下限、域值。进一步，所述聚类分析包括：1)利用SAS软件，对芯片扫描得到的数据进行标准化处理，并采用欧式距离计算遗传距离；2)采用SHAN程序按本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于野生种质的优质棉花材料创制方法，其特征在于，所述基于野生种质的优质棉花材料创制方法具体包括：/n步骤一，提取野生种质的优质棉花材料DNA；/n步骤二，采用基因芯片筛选优质棉花材料相关优质或抗性基因；/n步骤三，将筛选的优质或抗性基因进行PCR扩增基因片段；/n步骤四，采用农杆菌转化法将扩增之后获得的基因片段导入现有优质棉花细胞内，并将其培育成一个完整的植株；/n步骤五，对得到的植株采用线束法进行自交得到F1代棉花；/n步骤六，将F1代棉花与母本进行回交得到F2代棉花，将F2代棉花与母本棉花再次回交得到F3代棉花，然后，通过自交纯合获得优质棉花材料。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于野生种质的优质棉花材料创制方法，其特征在于，所述基于野生种质的优质棉花材料创制方法具体包括：
步骤一，提取野生种质的优质棉花材料DNA；
步骤二，采用基因芯片筛选优质棉花材料相关优质或抗性基因；
步骤三，将筛选的优质或抗性基因进行PCR扩增基因片段；
步骤四，采用农杆菌转化法将扩增之后获得的基因片段导入现有优质棉花细胞内，并将其培育成一个完整的植株；
步骤五，对得到的植株采用线束法进行自交得到F1代棉花；
步骤六，将F1代棉花与母本进行回交得到F2代棉花，将F2代棉花与母本棉花再次回交得到F3代棉花，然后，通过自交纯合获得优质棉花材料。


2.如权利要求1所述基于野生种质的优质棉花材料创制方法，其特征在于，步骤一中，所述DNA提取方法具体包括：
(1)取1个3mm钢珠放入2mL离心管中，取野生棉花的新鲜叶片放入管中钢珠上面，再在棉花叶片上面放1个3mm钢珠，盖上离心管盖子；
(2)将离心管放入液氮中冷冻3min，取出放置在涡旋仪上振荡粉碎；
(3)待离心管中的叶片呈碎末状，加入定量预热(60℃)的DNA抽提缓冲液，置于60℃水浴30min；
(4)顺着离心管侧壁，用磁铁吸出钢珠；
(5)加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1的混合液，轻轻混匀；并在4℃12000r/min离心10min；
(6)将上清液移至新的1.5mL离心管中，加入1μLRNase(1mg/mL)，37℃下水浴30min；
(7)加2/3体积的异丙醇，轻轻摇匀，于－20℃条件下静置2～3h；
(8)取出样品，12000r/min离心10min，弃去上清液；
(9)加入500μL70％乙醇，轻柔洗涤，4000r/min离心5min，弃去上清液；重复3次；
(10)真空抽干DNA样品，加入200μLddH2O充分溶解，于-20℃备用。


3.如权利要求1所述基于野生种质的优质棉花材料创制方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：张胜昔，韩光明，陈全求，蓝家样，李国荣，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42