简易制备胎盘间充质干细胞外泌体的方法技术

本发明专利技术涉及由胎盘间充质干细胞简易制备细胞因子的方法。简易制备胎盘间充质干细胞外泌体的方法。具体的，涉及从胎盘间充质干细胞中分离提取外泌体的方法，包括如下步骤：培养胎盘间充质干细胞获得培养上清；将培养上清经葡聚糖凝胶柱层析得到层析液；使用切向流超滤系统对层析液进行浓缩，得到外泌体浓缩液；将外泌体浓缩液冷冻保存或者冷冻干燥。本发明专利技术方法呈现如说明书所述优异性质。

A simple method of preparing exosomes of placental mesenchymal stem cells

The invention relates to a simple method for preparing cytokines from placenta mesenchymal stem cells. A simple method for the preparation of placenta derived mesenchymal stem cell exosomes. Specifically, methods for separating and extracting exocrine from placental mesenchymal stem cells include the following steps: culture of placenta derived mesenchymal stem cells to obtain culture supernatant; culture supernatant to obtain chromatographic solution through Sephadex gel column chromatography; use tangential flow ultrafiltration system to concentrate the chromatography solution, and obtain exocrine concentrate; freeze the external secretion concentrate or freeze dry. The method of the invention has excellent properties as described in the specification.

【技术实现步骤摘要】
简易制备胎盘间充质干细胞外泌体的方法
本专利技术属于生物
，涉及一种获取参与细胞生物活动的膜泡的方法，尤其涉及一种由人胎盘间充质干细胞(MSC)分离并获取外泌体(Exosome，或记作Exosomes)的方法，以及其在细胞修复中的应用。特别地，本专利技术涉及人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是来源于中胚层的一类非造血系统多能干细胞，现已证实MSCs除具有自我更新和多向分化潜能外，还具有很强的抗炎和抑制多种免疫细胞的能力，并能够诱导外周免疫耐受。研究表明MSCs通过分泌多种免疫调节因子，如IFN-γ、PGE2等(可参见：PolchertD,SobinskyJ,DouglasG,KiddM,MoadsiriA,ReinaE,etal.IFN-gammaactivationofmesenchymalstemcellsfortreatmentandpreventionofgraftversushostdisease.Europeanjournalofimmunology.2008；38(6):1745-55.以及SpaggiariGM,AbdelrazikH,BecchettiF,MorettaL.MSCsinhibitmonocyte-derivedDCmaturationandfunctionbyselectivelyinterferingwiththegenerationofimmatureDCs:centralroleofMSC-derivedprostaglandinE2.Blood.2009；113(26):6576-83.)，从而抑制免疫细胞(如T细胞、B细胞、NK细胞、抗原呈递细胞等)的功能(可参见：CorcioneA,BenvenutoF,FerrettiE,GiuntiD,CappielloV,CazzantiF,etal.HumanmesenchymalstemcellsmodulateB-cellfunctions.Blood.2006；107(1):367-72.以及DiNicolaM,CarloStellaC,MagniM,MilanesiM,LongoniPD,MatteucciP,etal.HumanbonemarrowstromalcellssuppressT-lymphocyteproliferationinducedbycellularornonspecificmitogenicstimuli.Blood.2002；99(10):3838-43.)。外泌体(exosome)是一种由细胞分泌的直径约30～100nm，密度范围在1.13～1.19g/ml之间的膜性微囊泡。外泌体可携带多种与源细胞相似的蛋白质、mRNA、miRNA，参与免疫调节、细胞通讯、细胞迁移、血管新生等过程(可参见：Yanez-MoM,SiljanderPR,AndreuZ,ZavecAB,BorrasFE,BuzasEI,etal.Biologicalpropertiesofextracellularvesiclesandtheirphysiologicalfunctions.Journalofextracellularvesicles.2015；4:27066.)。Lai等发现MSCs来源的外泌体可减少心肌缺血再灌注损伤，并且证实外泌体的miRNA可以促进血管新生，因此外泌体可能成为治疗心血管疾病的一个新方向(可参见：LaiRC,ArslanF,LeeMM,SzeNS,ChooA,ChenTS,etal.ExosomesecretedbyMSCreducesmyocardialischemia/reperfusioninjury.Stemcellresearch.2010；4(3):214-22.)。Xin等发现MSCs来源的外泌体通过转移miR-133b到神经细胞，可促进神经轴突的生长(可参见：XinH,LiY,BullerB,KatakowskiM,ZhangY,WangX,etal.ExosomemediatedtransferofmiR-133bfrommultipotentmesenchymalstromalcellstoneuralcellscontributestoneuriteoutgrowth.Stemcells.2012；30(7):1556-64.)。Filipazzi等发现肿瘤细胞来源的外泌体可通过NK细胞激活型受体NKG2D(naturalkillergroup2,memberD)抑制T细胞和NK细胞的细胞毒性，从而影响宿主的免疫系统(可参见：FilipazziP,BurdekM,VillaA,RivoltiniL,HuberV.Recentadvancesontheroleoftumorexosomesinimmunosuppressionanddiseaseprogression.Seminarsincancerbiology.2012；22(4):342-9.)。外泌体(exosome)这种由活细胞分泌的膜泡，最早于1983年被发现。随着研究深入，发现其具有执行蛋白、核酸的运输，特异靶定受体细胞，交换蛋白和脂类或引发下游信号事件，参与细胞间的通讯等功能，而不断受到重视。外泌体携带蛋白质包括源细胞非特异性和源细胞特异性两类蛋白分子。前者可能与外泌体的生物发生和生物学作用有关，主要包括：细胞溶质蛋白、参与细胞内信号转导的蛋白、各种代谢酶、热休克蛋白和四跨膜蛋白；另一类是特殊蛋白质，这类蛋白质只存在于某种特殊的细胞分泌的外泌体，而这些特定细胞源的外泌体与其生物学功能有着密切联系，例如：分子来源的外泌体上含有MHCII类分子。因此，不同细胞源的外泌体所携带的信号分子不一样，发挥的功能也不尽相同。例如：肿瘤细胞分泌的外泌体能够介导血管再生肿瘤细胞增殖及免疫逃逸，而树突状细胞源性外泌体则能够引起机体有效的抗肿瘤免疫应答。目前研究发现，外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质rRNA和microRNA，并且外泌体能够通过生物屏障，在细胞间传递功能性核酸分子，从而发挥各种生物学功能，故外泌体有望成为一种新型给药途径及基因治疗载体。目前研究发现，间充质干细胞例如脐带或胎盘来源的外泌体携带有多种有效的细胞因子、蛋白和小分子核酸物质，可有效介导细胞增殖、凋亡和功能调节作用。研究发现，外泌体中含有血管内皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板增殖因子、肿瘤坏死因子和肿瘤生长因子等，具有抑制细胞凋亡、细胞的纤维化程度，促进血管发生有丝分裂和介导免疫反应等功能。实验证明，在使用间充质干细胞所分泌的外泌体携带的胰岛素样生长因子和血管内皮细胞生长因子是治疗急性肾损伤的关键主导因子。在免疫学方面，间充质干细胞分泌的外泌体脂膜表面表达有多种膜蛋白，如：凝血因子、肿瘤坏死因子、MHCI/II分子以及CCR5趋化因子受体等，这些脂膜表面蛋白对抵抗炎症具有重要的作用。目前进行外泌体提取的方式和途径也多种多样，如：骨髓中提取、外周血中提取等，这些外泌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.从胎盘间充质干细胞中分离提取外泌体的方法，该方法包括如下步骤：/n1)提供处于对数生长期的第2～5代人胎盘间充质干细胞，以5000～15000/cm

【技术特征摘要】
1.从胎盘间充质干细胞中分离提取外泌体的方法，该方法包括如下步骤：
1)提供处于对数生长期的第2～5代人胎盘间充质干细胞，以5000～15000/cm2的密度接种至包含2mM的L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基中培养，培养3-4天后，收集上清，以20000g离心力离心20min除去细胞以及碎片，再经0.22μm滤膜过滤，得到培养上清；
2)将Pudex葡聚糖凝胶过滤介质PudexG-25用玻璃棒引流导入层析柱中，边装边用玻璃棒搅拌；
3)装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再将步骤1)收集的培养上清加载到层析柱中；
4)盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，打开恒流泵和收集器装置，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱并收集包含细胞分泌物的洗脱馏份，作为层析液；
5)使用切向流超滤系统(例如仕必纯KR2i型切向流超滤系统)对层析液进行浓缩，用超纯水冲洗管路，安装100kD100cm2的MidiKros过滤器，对步骤4)所得层析液5L进行过滤浓缩，得到100ml浓缩50倍的回流液为外泌体浓缩液；任选的
6)将外泌体浓缩液分装，在-80℃条件冷冻保存；或者向外泌体浓缩液中添加冻干赋形剂后冷冻干燥。


2.根据权利要求1的方法，其中步骤1)中，以10000/cm2的密度接种细胞。


3.根据权利要求1的方法，其中步骤1)中，还包括向经0.22μm滤膜过滤所得滤液中添加甘露糖磷酸酯钠使溶解，作为培养上清。


4.根据权利要求3的方法，甘露糖磷酸酯钠添加的质量/体积百分浓度为0.05～0.1％。


5.根据权利要求3的方法，甘露糖磷酸酯钠添加的质量/体积百分浓度为0.08％。


6.根据权利要求1的方法，其中步骤1)中，处于对数生长期的第2～5代人胎盘间充质干细胞是照包括如下步骤的方法得到的：
(1)处理胎盘组织
将人胎盘去除羊膜，剪取胎盘小叶表层膜样组织，用生理盐水清洗；
将胎盘小叶表层膜样组织剪碎至体积大小约0.2cm3的组织碎块；
将组织碎块置离心管中，加入0.9％生理盐水适量，使用300目滤网过滤，并使用0.9％生理盐水适量再清洗两次，至滤液清澈；
将清洗后的组织加入含有0.005％的LiberaseMNP-S酶和0.05％的DNAI型酶的HBSS消化液中，充分混匀后，于摇床中振荡消化30min(37℃，100rpm)；
(2)获得胎盘原始细胞
消化结束后，在离心管中加入胎牛血清终止消化，混匀后使用含有5％右旋糖酐、2.5％人血清白蛋白、200U...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘冰，肖海蓉，李诣书，
申请(专利权)人：博雅干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32