本发明专利技术提供一种Wnt信号通路激活剂在制备改善低碱性磷酸酯酶症干细胞成骨分化能力异常产品中的应用。细胞实验揭示低碱性磷酸酯酶症牙髓干细胞成骨分化能力下降，细胞内经典Wnt信号通路关键调控因子受到抑制，利用经典Wnt信号通路的激活剂LiCl作用于成骨分化能力异常的牙髓干细胞，改善了成骨分化能力异常的牙髓干细胞分化特性。
Application of Wnt signal pathway activator in the preparation of products to improve the osteogenic differentiation ability of low alkaline phosphatase stem cells
The invention provides an application of Wnt signal pathway activator in the preparation of products for improving the osteogenic differentiation ability of low alkaline phosphatase stem cells. Cell experiments revealed that the osteogenic differentiation ability of dental pulp stem cells with low alkaline phosphatase was decreased, and the key regulatory factors of the classic Wnt signaling pathway were inhibited. LiCl, the activator of the classic Wnt signaling pathway, was used to act on the dental pulp stem cells with abnormal osteogenic differentiation ability, which improved the differentiation characteristics of dental pulp stem cells with abnormal osteogenic differentiation ability.
【技术实现步骤摘要】
Wnt信号通路激活剂在制备改善低碱性磷酸酯酶症干细胞成骨分化能力异常产品中的应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及Wnt信号通路激活剂在制备改善低碱性磷酸酯酶症干细胞成骨分化能力异常产品中的应用。
技术介绍
低碱性磷酸酯酶症(Hypophosphatasia，HPP)是由于肝/骨/肾型碱性磷酸酶基因（ALPL）突变导致其编码的组织非特异性碱性磷酸酶（tissue-nonspecificalkalinephosphatase，TNAP）蛋白活性缺陷造成的骨骼及牙齿骨量下降的遗传性疾病。低碱性磷酸酯酶症发病率高，轻中度为4/1000，重度为1/100000，重者可出现骨骼畸形、高钙血症、严重癫痫及出现呼吸系统并发症导致围产期死亡，严重威胁着人类的健康和生存质量。目前，临床治疗低碱性磷酸酯酶症主要围绕如何减少患者骨量丢失和防止癫痫发生，如：利用特立帕肽结合维生素B6治疗。现有的治疗方案仅能减缓HPP发病的时间，不能有效逆转骨量减少的事实，因此不能从根本上解决骨形成和骨再生缺陷这一首要问题。间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSC）是一种具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，这种干细胞在治疗骨组织、软骨、牙周及神经等组织缺损再生过程发挥重要作用。骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs）是从骨髓组织中分离培养的具有向成骨细胞细胞、成软骨细胞、脂肪肪细胞和成纤维细胞等多向分化潜能的干细胞，与骨组织发育和骨组织损伤修复密切相关。低碱性磷酸酯酶症患者体内的间充质干细胞由于ALPL突变可能导致细胞增殖、凋亡和多向分化潜能出现异常，导致使个体的骨骼系统和牙齿发育出现异常。我们研究团队发现低碱性磷酸酯酶症患者的骨髓间充质干细胞成骨细胞分化能力减弱，相反成脂肪细胞分化能力加强，这与低碱性磷酸酯酶症患者骨质下降密切相关。因此，以低碱性磷酸酯酶症患者的间充质干细胞作为寻找治疗低碱性磷酸酯酶症疾病药物的模型，筛选出有效改善或恢复低碱性磷酸酯酶症患者的间充质干细胞分化能力，为临床上治疗低碱性磷酸酯酶症提供方法。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的问题，提供了Wnt信号通路激活剂在制备改善低碱性磷酸酯酶症干细胞成骨分化能力异常产品中的应用。本专利技术利用经典Wnt信号通路的激活剂LiCl作用于分化能力异常的干细胞，改善了分化能力异常的干细胞成骨分化特性。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术第一方面，提供了Wnt信号通路激活剂在制备改善低碱性磷酸酯酶症干细胞成骨分化能力异常产品中的应用。优选地，所述经典Wnt信号通路激活剂为LiCl。本专利技术第二方面，提供一种产品，包含治疗有效量的LiCl。所述产品为LiCl注射液，或含LiCl的细胞培养液。本专利技术第三方面，提供了LiCl在制备细胞成骨诱导液中的应用。优选地，所述细胞成骨诱导液包含8-12mMLiCl、8-15nmol/L地塞米松、5-15mmol/Lβ-甘油磷酸钠、0.05-0.1g/L维生素C、0.5-2%青霉素-链霉素、2.5-10%胎牛血清，余量为α-MEM培养基。优选地，所述细胞成骨诱导液包含10mMLiCl、10nmol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、0.05g/L维生素C、1%青霉素-链霉素和5%胎牛血清，余量为α-MEM培养基。本专利技术第四方面，提供了LiCl在制备治疗干细胞成骨分化能力异常药物中的应用。本专利技术第五方面，提供了LiCl在制备治疗牙硬组织矿化异常药物中的应用。本专利技术第六方面，提供了LiCl在体外诱导干细胞成骨分化能力的应用。本专利技术第七方面，提供了LiCl在调控干细胞中p-GSK3β和/或active-β-catenin水平的应用。优选地，所述干细胞为骨髓间充质干细胞或牙髓干细胞。本专利技术第八方面，提供了一种激活Wnt信号通路的方法，包含以下步骤：1）获取成骨分化能力异常的干细胞；2）使用含LiCl的试剂诱导培养所述成骨分化能力异常的干细胞，持续培养3周以上。本专利技术第九方面，提供了一种调控干细胞中p-GSK3β或active-β-catenin水平的方法，包含以下步骤：1）获取成骨分化能力异常的干细胞；2）使用含LiCl的试剂诱导培养所述成骨分化能力异常的干细胞，持续培养3周以上。优选地，所述成骨分化能力异常的干细胞来源于低碱性磷酸酯酶症患者牙齿或从临床上废弃的低碱性磷酸酯酶症患者骨髓组织中分离的间充质干细胞。优选地，步骤1）中，包含成骨分化能力异常的干细胞经体外扩增培养的过程，所述体外扩增培养为贴壁培养，并传代培养3-5代。优选地，上述含LiCl的试剂为含8-12mMLiCl的生理盐水或含LiCl的细胞成骨诱导液。优选地，上述细胞成骨诱导液包含8-12mMLiCl、8-15nmol/L地塞米松、5-15mmol/Lβ-甘油磷酸钠、0.05-0.1g/L维生素C、0.5-2%青霉素-链霉素、2.5-10%胎牛血清，余量为α-MEM培养基。上述分化能力异常的离体牙髓干细胞可为基因突变发生于ALPL基因编码区的任一单个位点或多个位点突变所致碱性磷酸酯酶活力缺陷。本专利技术的实施例中，上述所用的分化能力异常的离体牙髓干细胞包含2个突变位点的ALPL基因。上述分化能力异常的离体牙髓干细胞的特征体现在：与正常离体牙髓干细胞相比，细胞的成骨细胞分化能力减弱、细胞内经典Wnt信号通路异常。本专利技术的实验证明，低碱性磷酸酯酶症的骨髓间充质干细胞或牙髓干细胞骨向分化能力减弱，细胞内经典Wnt信号通路受到抑制，本专利技术采用LiCl持续作用于分化能力异常的骨髓间充质干细胞或牙髓干细胞，通过改善细胞经典Wnt信号通路促进分化能力异常的骨髓间充质干细胞或牙髓干细胞向成骨细胞的分化能力；而且本方法采用了一种常见的成本低廉的小分子化合物LiCl，具有简单、高效的特点，实现了改善低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的骨髓间充质干细胞货牙髓干细胞的成骨分化能力，为临床上治疗低碱性磷酸酯酶症患者成骨分化能力异常或牙齿矿化异常提供潜在的治疗策略。附图说明图1A为正常间充质干细胞形态观察示意图；图1B为疾病间充质干细胞形态观察示意图；图2A为ALP染色后正常间充质干细胞成骨分化能力检测示意图；图2B为ALP染色后疾病间充质干细胞成骨分化能力检测示意图；图3A为茜素红染色后正常间充质干细胞成骨分化能力检测示意图；图3B为茜素红染色后疾病间充质干细胞成骨分化能力检测示意图；图4为间充质干细胞成骨分化能力基因RUNX2、SP7表达检测对照图；图5为间充质干细胞成骨分化相关基因RUNX2、SP7在mRNA和蛋白水平检测对照图；图6A为油红O染色后正常间充质干细胞成脂肪分化能力检测示意图；图6B为油红O染色后疾病间充质干细胞成脂肪分化能力检测示意图；...
【技术保护点】
1.Wnt信号通路激活剂在制备改善低碱性磷酸酯酶症干细胞成骨分化能力异常产品中的应用。/n
【技术特征摘要】
20180517 CN 2018104735132;20180517 CN 2018104739621.Wnt信号通路激活剂在制备改善低碱性磷酸酯酶症干细胞成骨分化能力异常产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述经典Wnt信号通路激活剂为LiCl。
3.一种产品，其特征在于，包含治疗有效量的LiCl。
4.LiCl在制备细胞成骨诱导液中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述细胞成骨诱导液包含8-12mMLiCl、8-15nmol/L地塞米松、5-15mmol/Lβ-甘油磷酸钠、0.05-0.1g/L维生素C、0.5-2%青霉素-链霉素、2.5-10%胎牛血清，余量为α-MEM培养基。
6.LiCl在制备治疗干细胞成骨分化能力异常药物中的应用。
7.LiCl在制备治疗牙硬组织矿化异常药物中的应用。
8.LiCl在体外诱导干细胞成骨分化能力的应用。
9.LiCl在调控干细胞中p-GSK3β和/或active-β-catenin水平的应用。
10.根据权利要求1，6-9任一项所述的应用，其特征在于，所述干细胞为骨髓间充质干细胞或牙髓干细胞。...
【专利技术属性】
技术研发人员：张立强，刘文佳，
申请(专利权)人：西安组织工程与再生医学研究所，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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