一种分离和扩增人尿源间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种分离和扩增人尿源间充质干细胞的方法，利用低血清分离培养基或无血清分离培养基对人尿源间充质干细胞进行分离，利用低血清扩增培养基和无血清扩增培养基对人尿源间充质干细胞进行扩增。本发明专利技术所述培养基在不影响人尿源间充质干细胞特性和增殖活性的基础上，通过不同浓度选择生长因子和激素的联合应用，设计出优化的低血清和无血清人尿源间充质干细胞培养基，降低了胎牛血清对尿源干细胞特性和分化的不利影响，稳定性更佳，更适用于科学研究。应用本发明专利技术所述培养基对人尿源MSC进行分离和扩增的方法简便易行，并且能够有效降低细胞污染风险。

A method for isolation and amplification of human urinary mesenchymal stem cells

The invention relates to a method for separating and expanding human urine derived mesenchymal stem cells, which uses a low serum separation medium or a serum-free separation medium to separate human urine derived mesenchymal stem cells, and uses a low serum expansion medium and a serum-free expansion medium to expand human urine derived mesenchymal stem cells. The culture medium of the invention does not affect the characteristics and proliferation activity of human urinary mesenchymal stem cells, and through the combined application of growth factors and hormones in different concentrations, an optimized low serum and serum-free human urinary mesenchymal stem cell culture medium is designed, which reduces the adverse effect of fetal bovine serum on the characteristics and differentiation of urinary stem cells, has better stability, and is more suitable for science Research. The method for isolating and amplifying the human urine source MSc by using the culture medium of the invention is simple and easy, and can effectively reduce the risk of cell pollution.

【技术实现步骤摘要】
一种分离和扩增人尿源间充质干细胞的方法
本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种分离和扩增人尿源间充质干细胞的方法。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSC)是成体干细胞家族的重要成员，MSC最初在骨髓中发现，后相继从脂肪、脐带、脐血等组织提取出间充质干细胞，作为多能干细胞，MSC具有多项分化潜能、促进免疫调控和自我更新能力强等特点，成为最广泛应用的成体干细胞，可作为理想的种子细胞用于衰老、疾病等引起的组织器官修复。但其分离提取方法通常有创，且成本较高，制约了其在临床科研中的应用。从尿液中分离提取间充质干细胞具有干细胞特性，包括多向分化和自我更新能力，由于其提取方法无创，来源简便，容易获取，自体移植无免疫排斥问题，成为了生物研究及组织工程领域理想的种子细胞。目前，用于其培养的培养基大致分为以下几类：(1)AlessandraFerlini等报道的培养基成分为50％肾上皮细胞生长培养基、50％DMEM、10％胎牛血清、1％GlutaMAX、1％非必需氨基酸、1％抗生素/抗真菌溶液、5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、5ng/ml血小板衍生生长因子、5ng/ml表皮生长因子；(2)Zhang等报道的培养基，其具体成分为50％角质细胞无血清培养液、2.5μg/L表皮生长因子、25μg/L牛脑垂体提取物、1％青链霉素、1％L-谷氨酰胺、37.5％DMEM、12.5％Ham’sF-12培养液、5％胎牛血清、0.2mg/L氢化可的松、5μg/L胰岛素、2.5mg/L转铁蛋白、1×10-9mol/L三碘甲腺原氨酸、5μg/L表皮生长因子、0.9×10-4mol/L腺嘌呤；(3)YangWang等报道的培养基成分为DMEM培养基添加2％胎牛血清、10ng/mL人表皮生长因子、2ng/mL血小板衍生生长因子、1ng/mL转化生长因子-b、2ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、0.5mM皮质醇、25mg/mL胰岛素、20mg/mL转铁蛋白、549ng/mL肾上腺素、50ng/mL三碘甲腺原氨酸、L-谷氨酰胺和抗生素。通常添加一定量的胎牛血清，上述三种用于培养尿源间充质干细胞的培养基中均添加一定量的胎牛血清，然而在实际应用中，含血清培养基存在多种缺点：(1)增加了干细胞对血清的外源性依赖；(2)血清由于不同批次成分不一，给细胞培养的标准化带来困难，同时也给细胞表达的目的产物纯化带来困难；(3)血清中成分不明的生长/抑制因子会影响干细胞特性和分化潜能；(4)血清易受病毒、支原体或其他病原体的污染，成为潜在致病源；(5)血清获取成本高，价格较贵。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的上述问题，本专利技术提供了一种用于分离和扩增人尿源间充质干细胞的培养基及分离和扩增方法，所述分离培养基和扩增培养基均包括基础培养基和添加剂。应用本专利技术所述培养基对人尿源MSC进行分离和扩增的方法简便易行，并且能够有效降低细胞污染风险。本专利技术所采用的技术方案为：用于分离和扩增人尿源间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将尿液进行离心，得到细胞沉淀；向所述细胞沉淀中加入低血清分离培养基或无血清分离培养基，吹打混匀后进行培养，得到原代细胞，记作第0天；(2)第12-13天，对所述原代细胞进行消化，使用所述低血清分离培养基或无血清分离培养基对细胞进行重悬、接种，记为P1代，即完成人尿源间充质干细胞的分离；(3)使用低血清扩增培养基或无血清扩增培养基对P1代细胞进行传代培养，即完成人尿源间充质干细胞的扩增。进一步地，步骤(1)和(2)中，所述低血清分离培养基和无血清分离培养基均包含基础培养基和添加剂；所述基础培养基为DMEM培养基、F12-K培养基和KSFM培养基组成的混合体系；以基础培养基的体积作为基准，所述添加剂的组成为：谷氨酰胺0.2-2mM、抗生素10-100U/mL、重组人胰岛素1×10-3-0.1mg/mL、人表皮生长因子1×10-6-5×10-5mg/mL、血小板衍生生长因子1×10-6-5×10-5mg/mL、碱性成纤维细胞生长因子1×10-6-5×10-5mg/mL、人转铁蛋白1×10-3-5×10-2mg/mL、亚硒酸1×10-3-8×10-2mg/mL、甘氨酸1-20mg/L、L-丙氨酸1-20mg/L、L-天冬酰胺1-20mg/L、L-天冬氨酸1-20mg/L、L-谷氨酸1-20mg/L、L-脯氨酸1-20mg/L、L-丝氨酸1-20mg/L、三碘甲状腺氨酸1×10-6-5×10-5mg/mL、营养添加剂0.1-100ul/mL、氢化可的松0.1-10uM、肾上腺素1×10-4-1×10-2mg/mL。进一步地，所述低血清分离培养基中，所述营养添加剂为胎牛血清，所述胎牛血清的浓度为0.1-50ul/mL。进一步地，所述无血清分离培养基中，所述营养添加剂为血清替代成分，所述血清替代成分的浓度为0.1-100ul/mL。进一步地，所述DMEM培养基、F12-K培养基和KSFM培养基的体积比为(1-2):(1-2):(1-2)。进一步地，步骤(3)中，所述低血清扩增培养基和无血清扩增培养基均包含基础培养基和添加剂；所述基础培养基为DMEM培养基和F12-K培养基的混合体系；以基础培养基的体积作为基准，所述添加剂的组成为：谷氨酰胺0.2-2mM、抗生素10-100U/mL、重组人胰岛素1×10-3-0.2mg/mL、人表皮生长因子1×10-6-1×10-4mg/mL、血小板衍生生长因子1×10-6-1×10-4mg/mL、碱性成纤维细胞生长因子1×10-6-1×10-4mg/mL、人转铁蛋白1×10-3-0.1mg/mL、亚硒酸1×10-3-0.16mg/mL、甘氨酸1-40mg/L、L-丙氨酸1-40mg/L、L-天冬酰胺1-40mg/L、L-天冬氨酸1-40mg/L、L-谷氨酸1-40mg/L、L-脯氨酸1-40mg/L、L-丝氨酸1-40mg/L、三碘甲状腺氨酸1×10-6-1×10-4mg/mL、营养添加剂0.1-100ul/mL、氢化可的松0.1-20uM、肾上腺素1×10-4-2×10-2mg/mL。进一步地，所述DMEM培养基和F12-K培养基的体积比为(1-2):(1-2)。进一步地，所述低血清扩增培养基中，所述营养添加剂为胎牛血清，所述胎牛血清的浓度为0.1-20ul/mL。进一步地，所述无血清扩增培养基中，所述营养添加剂为血清替代成分，所述血清替代成分的浓度为0.1-100ul/mL。进一步地，所述血清替代成分为粘附因子、白蛋白和维生素按照质量比1×10-4-1×10-2：1-50：1×10-3-1×10-2组成的混合物本专利技术的有益效果为：本专利技术所述用于分离和扩增人尿源MSC(间充质干细胞)的培养基包括分离培养基和扩增培养基，所述分离培养基和扩增培养基的组成均包括基础培养基和添加剂。本专利技术培养基优化了既往培养基成分配比，通过添加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离和扩增人尿源间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)将尿液进行离心，得到细胞沉淀；向所述细胞沉淀中加入低血清分离培养基或无血清分离培养基，吹打混匀后进行培养，得到原代细胞，记作第0天；/n(2)第12-13天，对所述原代细胞进行消化，使用所述低血清分离培养基或无血清分离培养基对细胞进行重悬、接种，记为P1代，即完成人尿源间充质干细胞的分离；/n(3)使用低血清扩增培养基或无血清扩增培养基对P1代细胞进行传代培养，即完成人尿源间充质干细胞的扩增。/n

【技术特征摘要】
1.一种分离和扩增人尿源间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将尿液进行离心，得到细胞沉淀；向所述细胞沉淀中加入低血清分离培养基或无血清分离培养基，吹打混匀后进行培养，得到原代细胞，记作第0天；
(2)第12-13天，对所述原代细胞进行消化，使用所述低血清分离培养基或无血清分离培养基对细胞进行重悬、接种，记为P1代，即完成人尿源间充质干细胞的分离；
(3)使用低血清扩增培养基或无血清扩增培养基对P1代细胞进行传代培养，即完成人尿源间充质干细胞的扩增。


2.根据权利要求1所述的分离和扩增人尿源间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中，所述低血清分离培养基和无血清分离培养基均包含基础培养基和添加剂；
所述基础培养基为DMEM培养基、F12-K培养基和KSFM培养基组成的混合体系；
所述添加剂的组成为：谷氨酰胺0.2-2mM、抗生素10-100U/mL、重组人胰岛素1×10-3-0.1mg/mL、人表皮生长因子1×10-6-5×10-5mg/mL、血小板衍生生长因子1×10-6-5×10-5mg/mL、碱性成纤维细胞生长因子1×10-6-5×10-5mg/mL、人转铁蛋白1×10-3-5×10-2mg/mL、亚硒酸1×10-3-8×10-2mg/mL、甘氨酸1-20mg/L、L-丙氨酸1-20mg/L、L-天冬酰胺1-20mg/L、L-天冬氨酸1-20mg/L、L-谷氨酸1-20mg/L、L-脯氨酸1-20mg/L、L-丝氨酸1-20mg/L、三碘甲状腺氨酸1×10-6-5×10-5mg/mL、营养添加剂0.1-100ul/mL、氢化可的松0.1-10uM、肾上腺素1×10-4-1×10-2mg/mL。


3.根据权利要求2所述的分离和扩增人尿源间充质干细胞的方法，其特征在于，所述低血清分离培养基中，所述营养添加剂为胎牛血清，所述胎牛血清的浓度为0.1-50ul/mL。


4.根据权利要求2所述的分离和扩增人尿源间充质干细胞的方法，其特征在于，所述无血清分离培养基中，所述营养添加剂为血清替代成分，所述血清替代成分的浓度为0.1-100ul/mL。


5.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：上海亚载生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31