一种基因分型的检测方法及计算方法技术

本发明专利技术涉及一种基因分型的检测方法，所述检查方法包括以下步骤：采取唾液样本后再提取样本中核酸并扩增；将扩增后的核酸进行酶切后沉淀；沉淀重悬后与微珠芯片进行杂交，杂交完毕后清洗微珠芯片；再将杂交上样本DNA的微珠芯片进行单碱基延伸，染色；最后使用Illumina Infinium LCG扫描微珠芯片得到结果值。并进一步采用本发明专利技术给出的计算方法对基因分型检测结果进行分析可得到所需项目的等级判断。该方法所需的样本量小，对提供的位点的权值进行统一再比较，所得到的GRS更准确。

A method of genotyping detection and calculation

The invention relates to a detection method for gene typing, the detection method comprises the following steps: Taking saliva sample, extracting nucleic acid from sample and amplifying it; enzyme cutting and depositing the amplified nucleic acid; hybridization with bead chip after precipitation and heavy suspension, cleaning and washing the bead chip after hybridization; single base extension and staining of bead chip of sample DNA on hybridization The results were obtained by scanning the bead chip with Illumina Infinium LCG. Further, the calculation method provided by the invention is used to analyze the result of gene typing detection, and the grade judgment of the required item can be obtained. This method needs a small sample size, and the GRS obtained by the method is more accurate by comparing the weights of the provided loci.

【技术实现步骤摘要】
一种基因分型的检测方法及计算方法
本专利技术属于生物基因分型
，涉及一种基因分型的检测方法及计算方法。
技术介绍
儿童营养评估主要是对其机体营养状况进行系统观察和检测，然后对营养状态进行全面综合评定。常用指标包括：膳食调查、人体测量、生化检查、临床检查。但是，上述方法多是间接地或短暂地测试人体营养元素的现状，并且多以主观评价法为主，没有统一的评价标准。因此，无法真正反映人体先天的营养特质。此外，大量研究发现，每个孩子对于不同营养素的吸收和代谢在基因层面存在个体差异，故各种营养素的需求量因人而异。综上所述，营养现状评估只能反映人体营养的一个侧面，无法给出客观的评估结果以及个性化和综合性的指导建议。基因型主要是指单核苷酸位点突变的类型，SNP(SingleNucleotidePolymorphism)是指在基因组水平上的单个核苷酸多态。SNP可能会影响其所在基因或关联基因的功能与表达，从而导致个体间的差异。基于基因芯片检测的基因分型数据进行等级划分可为儿童营养评估做出较为客观的参考。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基因分型的检测方法，还提供一种根据基因分型的检测方法得到检测结果进行等级划分的计算方法。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1、一种基因分型的检测方法，所述检查方法包括以下步骤：1)样本采集，取唾液；2)再提取样本中核酸并扩增；3)将步骤2)扩增后的核酸进行酶切后沉淀；4)重悬后与微珠芯片进行杂交，杂交完毕后清洗微珠芯片；5)再将杂交上样本DNA的微珠芯片进行单碱基延伸，染色；6)最后使用IlluminaInfiniumLCG扫描微珠芯片得到结果值。进一步，所述步骤2)提取样本中核酸为：将200ul样本加入60ul蛋白酶K和600ul裂解液，涡旋混匀后水浴30min；瞬时离心后加入600ul无水乙醇，混匀后2000-5000g离心；离心后的上清液全部加入已装入收集管的吸附柱中，13000g离心1min，去废液，将吸附柱重新放入收集管；加入500ul清洗缓冲液1，离心，去废液，将吸附柱重新放入收集管；加入500ul清洗缓冲液2，13000g离心2min，去废液，将吸附柱置于新的EP管中，室温晾干；向吸附柱的中间悬空加入40ulTEbuffer，室温放置2min，13000g离心1min，收集DNA洗脱液，测浓度，用TEbuffer调整至50ng/μl。进一步，所述步骤2)的DNA扩增方法为：将DNA4μL加入20μL封闭液，4μL的0.1MNaOH，2000rpm涡旋1min；350-500g离心1min；室温孵育10min；再加入34μL中和液和38μL扩增试剂，2000rpm涡旋1min；350-500g离心30s；杂交恒温箱中37℃孵育20-24h。进一步，所述封闭液为MA1；所述中和液为MA2，所述扩增试剂为MSM，DNA扩增在MSA396孔板中进行。进一步，所述步骤3)的酶切方法为：将扩增后的DNA中加入25μL酶切试剂后1600rpm涡旋震荡1min，50xg离心1min；于37℃的加热板上孵育1h进行酶切；酶切后沉淀方法为：酶切后样品加入50μL酶切终止液，密封好后1600rpm涡旋1min；37℃孵育5min；280xg离心1min；再加入155μL的异丙醇，混匀后4℃孵育30min；4℃下3,000xg离心20min；倒置让液体流干并保持1小时以上以使沉淀完全干燥。进一步，所述酶切试剂为FMS，所述酶切终止液为PM1。进一步，所述步骤4)的具体方法为：将每个样品中加入23μL重悬液RA1；密封好后放在Illumina恒温杂交箱中48℃1h；时间结束后1800rpm涡旋1min；280xg短暂离心30-60S；将MSA3板置于加热板上95℃孵育20min以将样品变性，冷却至室温，从MSA3板每个加样孔中各吸取17μL的DNA样品缓慢向加样孔注入至微珠芯片，以保证样品完全分散到微珠芯片上；微珠芯片放至杂交槽中，最后放入恒温杂交箱中，48℃孵育16-24h。进一步，所述清洗缓冲液1为0.1MMOPS，pH6.5；所述清洗缓冲液2为0.1MMOPS，50mMNaCl，pH6.5。2、根据以上任一项所述基因分型的检测方法得到检测结果进行等级划分的计算方法，其特征在于，所述计算方法的步骤为：将SNP位点同已经过审核发表的GWAS进行比较；并统一SNP位点的权值，权值主要有三种形式，OR值、β值或zscore值，统一公式如下：ln(OR)＝β转换之后采用下面的公式进行一场位点判定：|β-mean(β)|>3σ判定为异常位点后，需要对该位点进行权值调整，权值调整公式如下：Set0：该项目所有位点Set1＝Set0-outlier其中，Outlier为步骤b判定不合格的位点数量；计算GRS，根据样本在所选定项目中的危型碱基数量和位点权值计算GRS，GRS计算公式如下：其中公式中的OR为位点权重，X为危型碱基的数量；等级划分：基于群体GRS分布情况，使用mean和标准差sd，进行等级划分设定，根据每个项目使用的位点碱基频率，基于样本基因数据库，得到GRS分布图，然后再根据GRS分布图计算出样本群体的mean&sd，最后根据得到的mean&sd值采用下面的公式进行等级划分：设置阈值系数xs：xs＝1+1.5/(lnN+1.5)Level_1：<(mean-xs×sd)Level_2：(mean-xs×sd)-(mean+xs×sd)Level_3：>(mean+xs×sd)N值为有效位点的数量，即Set1。进一步，所述SNP位点必须满足：(1)其频率大于1；(2)至少一篇文献中p值在Bonferroni校正后仍然保持显著相关性；所述参考文献至少满足以下中的任意两点：i.一篇文献样本人群为中国人；ii.一篇文献来自中国人之外的东亚人种；iii.两篇以上独立文献支持；iv.一篇文献对位点所在基因提供生理功能支持。本专利技术的有益效果在于：本专利技术所提供的检测方法所需的样本量小。对基因分型的检测方法得到检测结果进行等级划分的计算方法先对所提供的位点的权值进行统一再比较，所得到的GRS更准确。每个用户都可以得到自己在某个特征项目上的GRS得分，根据得分，参考这一特征项目的相关位点在人群中的碱基频率，模拟出人群的GRS得分分布情况，将人群划分为3至5类，分别给予不同程度标签，以提供不同解读。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为GRS分布示意图。具体实施方式根据说明书附图，下面对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因分型的检测方法，其特征在于，所述检查方法包括以下步骤：/n1)样本采集，取唾液；/n2)再提取样本中核酸并扩增；/n3)将步骤2)扩增后的核酸进行酶切后沉淀；/n4)重悬后与微珠芯片进行杂交，杂交完毕后清洗微珠芯片；/n5)再将杂交上样本DNA的微珠芯片进行单碱基延伸，染色；/n6)最后使用Illumina Infinium LCG扫描微珠芯片得到结果值。/n

【技术特征摘要】
1.一种基因分型的检测方法，其特征在于，所述检查方法包括以下步骤：
1)样本采集，取唾液；
2)再提取样本中核酸并扩增；
3)将步骤2)扩增后的核酸进行酶切后沉淀；
4)重悬后与微珠芯片进行杂交，杂交完毕后清洗微珠芯片；
5)再将杂交上样本DNA的微珠芯片进行单碱基延伸，染色；
6)最后使用IlluminaInfiniumLCG扫描微珠芯片得到结果值。


2.根据权利要求1所述的基因分型的检测方法，其特征在于，所述步骤2)提取样本中核酸为：将200ul样本加入60ul蛋白酶K和600ul裂解液，涡旋混匀后水浴30min；瞬时离心后加入600ul无水乙醇，混匀后2000-5000g离心；离心后的上清液全部加入已装入收集管的吸附柱中，13000g离心1min，去废液，将吸附柱重新放入收集管；加入500ul清洗缓冲液1，离心，去废液，将吸附柱重新放入收集管；加入500ul清洗缓冲液2，13000g离心2min，去废液，将吸附柱置于新的EP管中，室温晾干；向吸附柱的中间悬空加入40ulTEbuffer，室温放置2min，13000g离心1min，收集DNA洗脱液，测浓度，用TEbuffer调整至50ng/μl。


3.根据权利要求1所述的基因分型的检测方法，其特征在于，所述步骤2)的DNA扩增方法为：将DNA4μL加入20μL封闭液，4μL的0.1MNaOH，2000rpm涡旋1min；350-500g离心1min；室温孵育10min；再加入34μL中和液和38μL扩增试剂，2000rpm涡旋1min；350-500g离心30s；杂交恒温箱中37℃孵育20-24h。


4.根据权利要求3所述的基因分型的检测方法，其特征在于，所述封闭液为MA1；所述中和液为MA2，所述扩增试剂为MSM，DNA扩增在MSA396孔板中进行。


5.根据权利要求4所述的基因分型的检测方法，其特征在于，所述步骤3)的酶切方法为：将扩增后的DNA中加入25μL酶切试剂后1600rpm涡旋震荡1min，50xg离心1min；于37℃的加热板上孵育1h进行酶切；酶切后沉淀方法为：酶切后样品加入50μL酶切终止液，密封好后1600rpm涡旋1min；37℃孵育5min；280xg离心1min；再加入155μL的异丙醇，混匀后4℃孵育30min；4℃下3,000xg离心20min；倒置让液体流干并保持1小时以上以使沉淀完全干燥。


6.根据权利要求5所述的基因分型的检测方法，其特征在于，所述酶切试剂为FMS，所述酶切终止液为PM1。


7.根据权利要求5所述的基因分型的检测方法，其特征在于，所述步骤4)的具体方法为：将每个样品中加入23μL重悬...

【专利技术属性】
技术研发人员：何荣军，何皓璠，赵锐，朱慧彬，杨雨，赵宗宝，洪小平，
申请(专利权)人：苏州因顿医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32