本发明专利技术公开了一种重组酯酶及其在催化邻苯二甲酸酯制备邻苯二甲酸中的应用，所述重组酯酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术重组酯酶可以降解多种PAEs底物，在30min内可将250mg/L的邻苯二甲酸二乙酯(DEP)完全催化为邻苯二甲酸(PA)，DBP可水解约96.8％，DMP可水解约46.4％，可应用于邻苯二甲酸酯污染的生物修复。
A recombinant esterase and its application
The invention discloses a recombinant esterase and its application in catalyzing the preparation of phthalate from phthalate, and the amino acid sequence of the recombinant esterase is shown in SEQ ID No.2. The recombinant esterase of the invention can degrade a variety of PAEs substrates, and can completely catalyze 250mg / L of diethyl phthalate (DEP) to phthalic acid (PA) within 30min. DBP can be hydrolyzed by water about 96.8%, DMP can be hydrolyzed by water about 46.4%, which can be applied to bioremediation of phthalic acid ester pollution.
【技术实现步骤摘要】
一种重组酯酶及其应用(一)
本专利技术涉及一种重组酯酶及其应用。(二)
技术介绍
邻苯二甲酸酯(Phthateacidesters，PAEs)是世界上广泛使用的人工合成的难降解有机化合物，主要用于塑料增塑剂、涂料、油漆等的化工生产。已有证据表明，PAEs是一类环境内分泌干扰物，其最明显的危害是使生殖机能下降，对动物及人类生殖系统有一定损害，可引起睾丸萎缩、精子减少、生殖细胞超微结构改变，且对胚胎发育有一定毒性。微生物降解被认为是自然环境中PAEs完全矿化的主要过程，过去的研究中已分离到多种微生物表现出了降解邻苯二甲酸酯的能力。经典的邻苯二甲酸酯降解途径认为，不管在有氧还是无氧条件下，邻苯二甲酸酯类在相关酯酶作用下先水解为邻苯二甲酸单酯，再进一步水解为邻苯二甲酸(PA)，在有氧环境下，邻苯二甲酸通过邻苯二甲酸双加氧酶反应生成二羟基邻苯二甲酸，经过脱氢和脱羧最后形成原儿茶酸；原儿茶酸可通过正位或偏位开环形成相应的有机酸，进而转化成丙酮酸、琥珀酸、草酰乙酸等进入三羧酸循环，最终转化为CO2和H2O。其中酯键的水解是一个共同的关键起始步骤，起始该过程的邻苯二甲酸酯水解酶(PAEs酯酶)也是PAEs降解途径的关键酶，是PAEs降解研究的重点关注对象。本专利技术在对Arthrobactersp.ZJUTW进行基因组测序的基础上，利用基因组挖掘技术分析该菌株中的PAEs代谢相关基因，根据基因组测序和功能注释信息结果，设计引物，扩增获得PAEs酯酶基因pehA，利用pET-28a表达系统在EscherichiacoliBL21(DE3)进行诱导表达和纯化，得到了重组纯化酯酶，对其进行生物信息学分析和功能验证，并考察了其基本酶学特性，野生菌株产酶能力不高、发酵周期长、易受环境影响，限制了其推广应用，而重组酯酶容易大量生产，并利用其耐碱性能力较强，有一定的耐温性，具有更好的应用前景。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种重组酯酶及其应用，可用于邻苯二甲酸酯的酶法降解。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种重组酯酶，所述重组酯酶氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供一种所述重组酯酶的编码基因，所述编码基因为SEQIDNO.1中4174bp-4896bp所示。本专利技术提供一种所述重组酯酶编码基因构建的重组载体，以及重组载体转化制备的重组基因工程菌，其中重组载体优选pET28a，宿主优选大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)。本专利技术还提供一种重组酯酶在催化邻苯二甲酸酯制备邻苯二甲酸中的应用，所述的应用为：以含重组酯酶编码基因的工程菌诱导培养获得的湿菌体经超声破碎提取的纯酶为催化剂，以邻苯二甲酸酯为底物，以pH7.0-10.0的PBS缓冲液为反应介质，在30-50℃条件下进行水解反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得邻苯二甲酸。进一步，所述邻苯二甲酸酯为邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二辛酯(DEHP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)或邻苯二甲酸二甲酯(DMP)。进一步，所述底物加入量以反应介质体积计为10-400mg/L(优选250mg/L)，所述催化剂加入量以反应介质体积计为0.15～0.6U/mL(优选0.6U/mL)。进一步，所述催化剂按如下方法制备：将含重组酯酶编码基因的工程菌(优选大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-pehA)接种于含50ng/mL卡那霉素(Kana)的LB培养基中，37℃，180r/min摇床培养至OD600为0.6，于22℃，180r/min摇床放置30min后，加入终浓度为1mM的IPTG诱导，22℃培养16-18h后，将菌体重悬到4℃预冷的结合缓冲液(bindingbuffer)(pH8.0)中，进行超声破碎；超声破碎的条件为：功率175W，工作3s，间歇3s，总工作时间为3min；将破碎后的细胞裂解液在4℃下12000rpm离心15min，上清液经0.45μm的微孔滤膜过滤后上镍柱(1mlNi-NTA预装色谱柱)，待上清液流尽，加入3倍体积的洗脱缓冲液(Elutionbuffer)进行洗脱，将结合在镍柱上的目标蛋白洗脱并收集流出的洗脱液，获得纯化的重组酯酶；结合缓冲液(bindingbuffer)组成：20mMTris-HCl，0.5MNaCl，10mM咪唑，pH8.0；洗脱缓冲液(Elutionbuffer)组成：20mMTris-HCl，0.5MNaCl，250mM咪唑，pH8.0。所述LB培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，溶剂为蒸馏水，pH7.0，121℃灭菌20min。与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：本专利技术根据Arthrobactersp.ZJUTW全基因组测序和生物信息学分析，获得了重组酯酶基因pehA，克隆并构建了重组表达质粒pET28a-pehA，转化到EscherichiacoliBL21(DE3)中完成异源表达和纯化。该重组酯酶基因pehA全长723bp，编码240个氨基酸残基，蛋白分子量26.19kDa，无信号肽，pI值为4.2；blastn比对发现，在已报道的Arthrobacter属中无相似序列，系统发育分析显示与GordoniaQH-11的alpha/betahydrolase处于同一分支；酶学性质分析结果显示，该酶的最适温度为50℃，最适pH为10.0，Fe3+对酶活有明显的促进作用，Ni2+则对酶活有抑制作用；该酯酶有较好的耐碱稳定性，在pH10.0条件下1小时后，仍具保留约70％的酶活性。本专利技术重组酯酶可以降解多种PAEs底物，在30min内可将250mg/L的邻苯二甲酸二乙酯(DEP)完全催化为邻苯二甲酸(PA)，DBP可水解约96.8％，DMP可水解约46.4％，可应用于邻苯二甲酸酯污染的生物修复。(四)附图说明图1表达载体构建简要流程图。图2电泳图，A为pehA基因扩增电泳图，B为pUCm-T-pehA载体的构建电泳图，C为pUCm-T-pehA载体的酶切鉴定电泳图，D为pET-pehA表达载体构建电泳图；M:DNAladder5000Marker；1:pehA；2:pUCm-T-pehA；3:pUCm-T-pehA用BamHI与HindIII双酶切；4,5:pET28a用BamHI与HindIII双酶切；6:成功构建的pET-pehA表达载体。图3实施例1步骤1.4.3中重组蛋白PehA诱导表达的SDS-PAGE图；M：蛋白分子量标准品；1：IPTG诱导后的细胞裂解液；3：未诱导的细胞裂解液；3：IPTG诱导后用镍柱纯化的重组蛋白。图4酯酶PehA的系统发育进化树。图5PehA多序列比对分析图；WP_005054944.1：alpha/betahydrolase[Microbacterium]；WP_024476681.1：alpha/betahydrolase[Actinobacteria]；WP_101851263.1：al本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组酯酶，其特征在于所述重组酯酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种重组酯酶，其特征在于所述重组酯酶氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。
2.一种权利要求1所述重组酯酶的编码基因，其特征在于所述编码基因为SEQIDNO.1中4174bp-4896bp所示。
3.一种权利要求1所述重组酯酶编码基因构建的重组载体。
4.一种权利要求3所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。
5.如权利要求4所述工程菌，其特征在于所述工程菌以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主构建而成。
6.一种权利要求1所述重组酯酶在催化邻苯二甲酸酯制备邻苯二甲酸中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用为：以含重组酯酶编码基因的工程菌诱导培养获得的湿菌体经超声破碎提取的纯酶为催化剂，以邻苯二甲酸酯为底物，以pH7.0-10.0的PBS缓冲液为反应介质，在30-50℃条件下进行水解反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得邻苯二甲酸。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述邻苯二甲酸酯为邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸二乙酯...
【专利技术属性】
技术研发人员：邱乐泉，吴石金，李骏，钟卫鸿，刘腾飞，尹辛格，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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