一种人类肺部滴虫感染检测的引物及试剂和方法技术

本发明专利技术为一种人类肺部滴虫感染检测试剂及检测方法和用途；其中，该检测试剂包括PCR反应液I和PCR反应液II；PCR反应液I包含扩增上下游引物1，PCR反应液II包含扩增上下游引物2。其中，该检测方法包括：引物设计，用引物配置PCR反应液I和PCR反应液II，病患样本采集和DNA提取，巢式PCR和电泳检测；巢式PCR产物还可以进行测序和系统发育进化树分析鉴定，从而实现引起人类肺部感染的多种滴虫的高灵敏度和特异性的一次性检测并鉴定。

A primer, reagent and method for detection of human pulmonary trichomonad infection

【技术实现步骤摘要】
一种人类肺部滴虫感染检测的引物及试剂和方法
本专利技术涉及人类肺部滴虫感染检测
，具体涉及利用巢式PCR法，测序技术以及数据分析实现引起人类肺部感染的多种滴虫一次性检测并鉴定的高灵敏度和特异性的检测方法。
技术介绍
滴虫是一种极微小有鞭毛的原虫生物，其可以感染人和动物的消化系统和生殖系统，其用肉眼无法看到，需要在显微镜下观察。滴虫一般都是经由性行为而感染，患滴虫性阴道炎的女性很多，女性患滴虫病并不新鲜。能够感染人体滴虫有阴道毛滴虫、口腔滴虫、人五毛滴虫等；这些滴虫都有感染人体肺部的报道，并逐渐开始为医师所知。显微镜镜检法，该方法简便、省时、费用低，目前仍是临床常用的方法。但是，其敏感度低，检测引导分泌物标本的敏感度仅为35％-80％；影响因素多，首先是滴虫在镜检固定过程中由于温度较低或者长时间的体外环境减少了检测的灵敏度。其次，肺泡的许多上皮细胞的移动方式与滴虫类似，这可能阻碍滴虫的检测。第三，滴虫可以发育变成一种变形虫形式，使它们变得无法辨认。因此，迫切需要建立一种敏感的分子方法来诊断肺毛滴虫病。但是，由于许多滴虫物种可以感染人肺，因此这样做更加复杂。现有的基于基因的检测方法已被用于检测单一类型的滴虫，缺少针对可能引起肺部感染的几种滴虫都能够检测的核酸分析方法。
技术实现思路
技术问题如下：第一方面，本专利技术提供一种人类肺部滴虫感染检测的引物，以该引物为基础的巢式PCR法，可以一次性检测人类肺部感染的多种滴虫，同时具有高灵敏度和特异性。第二方面，本专利技术提供了一种检测试剂，该检测试剂以巢式PCR法为基础，该检测试剂可以一次性检测人类肺部感染的多种滴虫。第三方面，本专利技术提供了一种基于上述检测试剂的人类肺部滴虫感染检测方法，该检测方法可以实现引起人类肺部感染的多种滴虫一次性检测并鉴定的高灵敏度和特异性的检测。技术方案如下：一种人类肺部滴虫感染检测的引物，所述的引物包含：扩增上下游引物1及其变体；扩增上下游引物2及其变体；其中，所述的扩增上下游引物1和引物2均是以不同种类滴虫的保守序列为模板设计，所述引物1和引物2的序列与人类支气管肺泡灌洗液中存在的核酸序列具有PCR退火条件下低互补结合能力；所述的扩增上下游引物2与扩增上下游引物1的关系为：扩增上下游引物2结合在扩增上下游引物1的PCR产物内部。所述的保守序列截取自不同种类滴虫的18SrRNA基因序列。所述的变体为参照引物的变体，所述的参照引物为扩增上下游引物1和扩增上下游引物2，所述的变体与所述的参照引物保持相同的扩增功能，所述相同的扩增功能为可以扩增出不同种类滴虫的基因，且无法扩增出人类支气管肺泡灌洗液中存在的本底基因。所述的变体的引物序列长度为18bp-27bp，GC含量为40-60％，自身不易形成严重的发卡结构和二聚体结构。所述的人类支气管肺泡灌洗液包括：正常人类的支气管肺泡灌洗液、患有或不患有肺部滴虫感染的人类支气管肺泡灌洗液、患病或不患病的人类的支气管肺泡灌洗液；所述的人类包括各个年龄段的人类。所述的低互补结合能力为PCR反应退火温度至多为45℃时，引物1和引物2的序列与人类支气管肺泡灌洗液中存在的核酸序列不会发生动态过程中的相对互补结合或可以发生部分互补结合但是无法到达延伸反应所需的结合自由能。所述的扩增上下游引物1为：TRC1-F5′-GGTAATTCCAGCTCTGCG-3′；TRC1-R5′-TGGTAAGTTTCCCCGTGT-3′。所述的扩增上下游引物2为：TRC2-F5′-GTTAAAACGCCCGTAGTC-3′；TRC2-R5′-CCAGAGCCCAAGAACTAT-3′。所述的不同种类的滴虫在进化树分支上属于不同物种或相同物种的亚种。所述的滴虫包括：阴道毛滴虫、口腔滴虫、人五毛滴虫和四毛滴虫。一种人类肺部滴虫感染的检测试剂，包含阳性对照、阴性对照、质控品以及巢式PCR通用试剂，该检测试剂还包括：PCR反应液I；所述的PCR反应液I包含扩增上下游引物1及其变体；PCR反应液II；所述的PCR反应液II包含扩增上下游引物2及其变体。该方法可以对人类肺部感染的多种滴虫一次性检测并鉴定，方法包括：以不同种类的滴虫的保守序列为模板设计引物，PCR反应液I和PCR反应液II制备，标本采集，巢式PCR一次性检测。该方法包括以下步骤：1)引物设计：针对进化树分支的不同滴虫物种，选择18SrRNA基因序列进行分析，序列比对分析得到保守序列，以该保守序列为模板，设计引物1和引物2，引物2结合在引物1的PCR产物内部；2)PCR反应液I和PCR反应液II制备：将获得的引物用水或缓冲液稀释得到；3)样本采集：生理盐水肺泡灌洗得灌洗液，离心，弃去上清液，收集沉淀作为样本；4)DNA提取：取支气管肺泡灌洗液沉淀物，进行DNA提取，获得DNA样本；5)巢式PCR：第一轮PCR：向反应管中加入PCR反应液I，DNA样本，配制PCR反应体系；PCR仪设置PCR反应条件，进行PCR获得PCR产物1；第二轮PCR：向反应管中加入PCR反应液II，PCR产物1，配制PCR反应体系；PCR仪设置PCR反应条件，进行PCR获得PCR产物2；6)PCR产物2电泳检测。步骤3)中，每位患者用20至120ml的生理盐水灌洗。所述的步骤4)中DNA提取方法可以选自DNA提取试剂盒、酚抽提法、甲酰胺解聚法、玻璃棒缠绕法、异丙醇沉淀法、表面活性剂快速制备法、加热法快速制备、碱变性快速制备中的任意一种。所述的DNA提取方法为DNA提取试剂盒。所述的步骤6)中PCR产物2电泳检测可以为琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳。其中，还包括巢式PCR最终PCR产物的测序和系统发育进化树分析鉴定。所述的系统发育进化树分析鉴定包括用基因组数据库BLAST分析鉴定和滴虫专业数据库18SrRNA进行序列比对分析鉴定。所述的基因组数据库为GenBank数据库,所述的滴虫专业数据库为国家生物技术信息中心数据库。有益效果如下：我们设计的人类肺部滴虫感染检测试剂及检测方法能够灵敏，特异地检测支气管肺泡灌洗液(BALF)标本中的滴虫。115个BALF样品中，10个样品在巢式PCR中呈阳性(10/115)，而在湿式显微镜检测中没有样品呈阳性(0/115)(P<0.01)，巢式PCR的阳性率显着高于显微镜。不仅如此，我们设计的巢式PCR具有高特异性，序列导入GenBank数据库中进行BLAST分析后，所有序列显示与毛滴虫序列的同源性(≈380bps)不低于99％。附图说明附图1为不同种滴虫的检测结果。附图2为巢式PCR法与显微镜镜检法的检测敏感性比较图。附图3为10例阳性标本PCR产物的电泳图。附图4为基于18SRNA序列的毛滴虫家族系统发育进化树。说明：附图1中，M：100-bpDNAmolecularsizemarkers；+：阳性质控(阴道毛滴虫)；–：阴性对照(人基因组)；1：弓形虫；2：蓝氏贾弟鞭毛虫；3：人五毛滴虫；4：阴道毛滴虫；5：口腔毛滴虫。附图2中，A:巢式PCR检测敏感性分析的凝胶电泳图；B:显微镜镜检法的敏感性分析图；M：100-bpDNA分子标志；+：阳性对照(阴道毛滴虫)；–：阴性对照(人基因组)；1–4：梯度稀释的含阴道毛滴虫的肺泡灌洗液标本(105104,103,102个滴本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人类肺部滴虫感染检测的引物，其特征在于，所述的引物包含：扩增上下游引物1及其变体；扩增上下游引物2及其变体；其中，所述的扩增上下游引物1和引物2均是以不同种类滴虫的保守序列为模板设计，所述引物1和引物2的序列与人类支气管肺泡灌洗液中存在的核酸序列具有PCR退火条件下低互补结合能力；所述的扩增上下游引物2与扩增上下游引物1的关系为：扩增上下游引物2结合在扩增上下游引物1的PCR产物内部。

【技术特征摘要】
1.一种人类肺部滴虫感染检测的引物，其特征在于，所述的引物包含：扩增上下游引物1及其变体；扩增上下游引物2及其变体；其中，所述的扩增上下游引物1和引物2均是以不同种类滴虫的保守序列为模板设计，所述引物1和引物2的序列与人类支气管肺泡灌洗液中存在的核酸序列具有PCR退火条件下低互补结合能力；所述的扩增上下游引物2与扩增上下游引物1的关系为：扩增上下游引物2结合在扩增上下游引物1的PCR产物内部。2.根据权利要求1所述的一种人类肺部滴虫感染检测的引物，其特征在于，所述的保守序列截取自不同种类滴虫的18SrRNA基因序列。3.根据权利要求1所述的一种人类肺部滴虫感染检测的引物，其特征在于，所述的变体为参照引物的变体，所述的参照引物为扩增上下游引物1和扩增上下游引物2，所述的变体与所述的参照引物保持相同的扩增功能，所述相同的扩增功能为可以扩增出不同种类滴虫的基因，且无法扩增出人类支气管肺泡灌洗液中存在的本底基因。4.根据权利要求3所述的一种人类肺部滴虫感染检测的引物，其特征在于，所述的变体的引物序列长度为18bp-27bp，GC含量为40-60％，自身不易形成严重的发卡结构和二聚体结构。5.根据权利要求1所述的一种人类肺部滴虫感染检测的引物，其特征在于，所述的人类支气管肺泡灌洗液包括：正常人类的支气管肺泡灌洗液、患有或不患有肺部滴虫感染的人类支气管肺泡灌洗液、患病或不患病的人类的支气管肺泡灌洗液；所述的人类包括各个年龄段的人类。6.根据权利要求1所述的一种人类肺部滴虫感染检测的引物，其特征在于，所述的低互补结合能力为PCR反应退火温度至多为45℃时，引物1和引物2的序列与人类支气管肺泡灌洗液中存在的核酸序列不会发生动态过程中的相对互补结合或可以发生部分互补结合但是无法到达延伸反应所需的结合自由能。7.根据权利要求1所述的一种人类肺部滴虫感染检测的引物，其特征在于，所述的扩增上下游引物1为：TRC1-F5′-GGTAATTCCAGCTCTGCG-3′；TRC1-R5′-TGGTAAGTTTCCCCGTGT-3′。8.根据权利要求1所述的一种人类肺部滴虫感染检测的引物，其特征在于，所述的扩增上下游引物2为：TRC2-F5′-GTTAAAACGCCCGTAGTC-3′；TRC2-R5′-CCAGAGCCCAAGAACTAT-3′。9.根据权利要求1所述的一种人类肺部滴虫感染检测的引物，其特征在于，所述的不同种类的滴虫在进化树分支上属于不同物种或相同物种的亚种。10.根据权利要求9所述的一种人类肺部滴虫感染检测的引物，其特征在于，所述的滴虫包括：阴道毛滴虫、口腔滴虫、人五毛滴虫和四毛滴虫。11.一种包含权利要求1-10的引物的检测试剂，包含阳性对照、阴性对照、质控品以及巢式PCR通用试剂，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡东伟，林超，周铁丽，应芙蓉，
申请(专利权)人：温州医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33