疟原虫基因诊断引物制造技术

本发明专利技术公开一种疟原虫基因诊断引物，该引物为检测/鉴定样品中是否存在特定疟原虫属和三个种疟原虫的环介导等温扩增(LAMP)引物，根据本发明专利技术，使用该引物组，可以同时或分别检测或鉴定疟原虫属和/或恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫中的一种或多种疟原虫的感染，能够为中国疟疾的诊断及治疗赢得宝贵时间，为实现疟疾流行的防控及消除提供帮助。

Primers for gene diagnosis of Plasmodium

【技术实现步骤摘要】
疟原虫基因诊断引物
本专利技术涉及生物检测及鉴定领域，尤其涉及一种能够快速和准确地检测与鉴定疟原虫感染的引物组，包括了疟原虫属、恶性疟、间日疟和卵形疟感染诊断的引物组。
技术介绍
在疟疾流行的国家，快速和准确地诊断疟疾是一项艰巨的挑战。不同的疟原虫引起的疟疾临床表现不一样，治疗方案不同，因此，疟疾诊断要求准确到虫种。在我国，许多输入性疟疾感染涉及两个或多个虫种，这些混合感染经常忽视或被低估。混合感染检测的失败导致疟疾治疗不充分，并可能导致疾病的加重及严重的并发症。因此，亟需开发一种可行的、简便、快速、高灵敏度和种属特异性强的疟疾诊断方法。目前，临床常用的疟疾的诊断方法是血涂片的显微镜检。如果寄生虫密度很高，这种镜检法具有相对较高的灵敏度和特异性并且能够确定疟原虫种及虫体的发育阶段。但该检测方法比较繁琐，工作量大，需要经过训练的专业人员操作，尤其是低原虫密度、经过治疗之后的疟疾诊断对技术熟练程度要求很高，出现误诊的几率大，尤其是在疟原虫密度通常较低的流行区，误诊常常导致治疗上的延误。在一些标准实验诊断无法开展的地区，为了提高疟疾诊断的速度和精确性，研究者们开发了基于免疫反应的疟疾快速诊断试验(RDT)。然而，产品间的灵敏度有波动，并且只有对恶性疟原虫的种特异性诊断的产品。因此，这种状况可导致假阴性的结果或不可靠的种诊断。后来，研究人员开发出用于疟疾诊断的基于DNA扩增技术的分子生物学方法，如巢式PCR和实时定量PCR。与显微镜相比，这些方法被证明对于混合感染具有较高的灵敏度和较好的特异性。然而，这种诊断方法耗时长，价格昂贵，需要完善的实验检测设备及专业的技术人员，从而限制了该项技术在疟疾流行区、基层医疗卫生机构中的应用。环介导等温扩增法(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是近年来新发展起来的一种恒温核酸扩增技术。LAMP法的特征是针对目标DNA链上的六个区段设计四个不同的引物，然后再利用链置换反应在一定温度下进行反应。反应只需要把基因模板、引物、链置换型DNA合成酶、基质等共同置于一定温度下(60～65℃)、经一个步骤即可完成。扩增效率极高，可在15分钟至1小时内实现109-1010倍的扩增，达到能够监测的效果。因此，不需要昂贵的PCR仪器，只需简单的恒温设施比如水浴锅就可以完成。结果判读可以肉眼观察浑浊度或者在产物中加入荧光染料,通过颜色变化来观察结果，简单的紫外灯或者在自然光下观察即可,不需要额外增加步骤。其具有简单、快速、高度灵敏、特异性强，无需特殊设备、对模板要求不高的特点。这些独特的优势使其更能为广大医务工作者所接受，而被推广。与PCR相当，检出的原虫密度更低。该方法对于操作人员的要求低，无需特殊训练即可完成。目前，国内市场除了免疫学诊断方法，没有敏感性更高、能方便地在基层开展应用的临床快速诊断试剂盒。
技术实现思路
为解决上述问题，亟需开发灵敏、特异、操作简单的符合我国流行特点的疟原虫感染诊断方法，该方法不同于镜检法、免疫学诊断法及PCR法等其他常用疟疾诊断方法。本专利技术的目的是提供灵敏、高效、操作简便的LAMP诊断引物，用来确定人血标本中是否有疟原虫感染或确定是否为恶性疟、间日疟或卵形疟三个具体虫种中的任一种或多种感染，能够为中国疟疾流行区的诊断及治疗赢得宝贵时间，为实现疟疾的防控及消除提供帮助。为解决以上问题，本专利技术应用恒温核酸扩增技术——环介导等温扩增(LAMP)技术实现高敏感性和特异性检测疟原虫感染的目的。在通过查找疟原虫属及恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫高度特异、保守的基因核苷酸序列，应用相关引物设计软件设计引物，并通过人工分析、实验确认，最终筛选出具有高度特异性及灵敏度的最佳引物组。应用专利技术人设计的疟原虫基因诊断引物组，能够快速、简易、准确地检测是否有疟原虫属寄生虫感染，并能确定是否为恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫中的某一种或多种寄生虫感染。即，本专利技术可提供下属的第1至6项描述的内容。1.疟原虫基因诊断引物用于同时或分别检测或鉴定疟原虫属和/或恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫中的一种或多种疟原虫的感染；疟原虫基因诊断引物是含有SEQ1至6表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增疟原虫属mtDNA基因序列的特定区域；含有SEQ7至12表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增恶性疟原虫ActinI基因序列的特定区域；含有SEQ13至18表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增间日疟原虫18SrRNA基因序列的特定区域；含有SEQ19至24表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增卵形疟原虫SSUrRNA基因序列的特定区域。2.根据第1项所述的用途，使用一个引物组来检测或鉴定疟原虫属的感染，该引物组包含含有SEQ1至6表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增疟原虫属mtDNA基因序列的特定区域。3.根据第1项所述的用途，使用一个引物组来检测或鉴定恶性疟原虫的感染，该引物组包含含有SEQ7至12表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增恶性疟原虫ActinI基因序列的特定区域。4.根据第1项所述的用途，使用一个引物组来检测或鉴定间日疟原虫的感染，该引物组包含含有SEQ13至18表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增间日疟原虫18SrRNA基因序列的特定区域。5.根据第1项所述的用途，使用一个引物来检测或鉴定卵形疟原虫的感染，该引物组包含含有SEQ19至24表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增卵形疟原虫SSUrRNA基因序列的特定区域。6、疟原虫基因诊断引物，含有SEQ1至6表示的核酸序列的寡核苷酸组；含有SEQ7至12表示的核酸序列的寡核苷酸组；含有SEQ13至18表示的核酸序列的寡核苷酸组；含有SEQ19至24表示的核酸序列的寡核苷酸组。本专利技术的有益效果本专利技术允许使用LAMP引物组，其中该引物组包含含有SEQ1至6表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增疟原虫属mtDNA基因序列的特定区域；含有SEQ7至12表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增恶性疟原虫ActinI基因序列的特定区域；含有SEQ13至18表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增间日疟原虫18SrRNA基因序列的特定区域；含有SEQ19至24表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增卵形疟原虫SSUrRNA基因序列的特定区域。从而允许同时或分别检测或区分任何人疟原虫感染或三种疟原虫之一的有无。使用本专利技术的疟原虫属或三种疟原虫的检测/鉴定方法，能够检测疟疾感染患者使用疟疾治疗药物的治疗效果。附图说明图1显示了LAMP靶标的位置，疟原虫属(A：mtDNA)、恶性疟原虫(B:PfActinI)、间日疟原虫(C:Pv18SrRNA)、卵形疟原虫(D:PoSSUrRNA)的引发位点以及疟原虫属mtDNA基因、恶性疟原虫actin基因、间日疟原虫18SrRNA基因、卵形疟原虫SSUrRNA基因的核苷酸序列，引物组引发位点的位置均用箭头表示。其中，基因核苷酸参考序列如下：疟原虫属mtDNA基因包括恶性疟原虫mtDNA基因(GenBank登记号M99416.1)、间日疟原虫mtDNA基因(GenBank登记号KF68441.1)、卵形疟原虫mtDNA基因(GenBank登记号HQ712052.1，HQ712053.1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.疟原虫基因诊断引物同时用于或分别用于检测或鉴定疟原虫属和/或恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫中的一种或多种疟原虫的感染；所述引物是含有SEQ 1至6表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增疟原虫属mtDNA基因序列的特定区域；含有SEQ 7至12表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增恶性疟原虫ActinI基因序列的特定区域；含有SEQ 13至18表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增间日疟原虫18S rRNA基因序列的特定区域；含有SEQ 19至24表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增卵形疟原虫SSU rRNA基因序列的特定区域。

【技术特征摘要】
1.疟原虫基因诊断引物同时用于或分别用于检测或鉴定疟原虫属和/或恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫中的一种或多种疟原虫的感染；所述引物是含有SEQ1至6表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增疟原虫属mtDNA基因序列的特定区域；含有SEQ7至12表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增恶性疟原虫ActinI基因序列的特定区域；含有SEQ13至18表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增间日疟原虫18SrRNA基因序列的特定区域；含有SEQ19至24表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增卵形疟原虫SSUrRNA基因序列的特定区域。2.根据权利要求1所述疟原虫基因诊断引物用途，使用引物组来检测或鉴定疟原虫属的感染，该引物组包含含有SEQ1至6表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增疟原虫属mtDNA基因序列的特定区域。3.根据权利要求1所述疟原虫基因诊断引物用途，使用引物组...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨照青，陈熙，张家祺，徐士玲，耿劲婷，黄亚铭，黄超，曾炜林，向征，杨照坤，
申请(专利权)人：昆明医科大学，
类型：发明
国别省市：云南,53