锥虫核酸实时荧光PCR检测用引物及试剂盒制造技术

本发明专利技术属于生化与分子生物学检测技术领域，涉及一种锥虫核酸实时荧光PCR检测用引物及试剂盒，所述锥虫核酸实时荧光PCR检测用引物是非洲锥虫引物时，所述非洲锥虫引物包括：前引物：GCTAACAGAAGCACTTRGTGAAGTT，后引物：CCGACATGTTGGCTTCAAGA；所述锥虫核酸实时荧光PCR检测用引物是美洲锥虫引物时，所述美洲锥虫引物包括：前引物：AACACAACAACCACACAAAACTACAA，后引物：CCACGCCACTTTTTTTCTTTTTTA。本发明专利技术提供的引物特异性与灵敏度强，试剂盒检测速度更快、实验操作更简便、能广泛应用。

Primers and kits for real-time fluorescent PCR detection of Trypanosoma nucleic acid

【技术实现步骤摘要】
锥虫核酸实时荧光PCR检测用引物及试剂盒
本专利技术属于生化与分子生物学检测
，涉及一种荧光PCR检测引物，尤其涉及一种锥虫核酸实时荧光PCR检测用引物及试剂盒。
技术介绍
锥虫(Trypanosoma)是引起人类等脊椎动物锥虫病(trypanosomiasis)的病原，寄生于寄主血液和组织引起的疾病。人类锥虫病主要有非洲锥虫病和美洲锥虫病，非洲锥虫病(Africantrypanosomiasis)又称昏睡病，病原为布氏锥虫冈比亚亚种(Trypanosomabruceigambiense)或布氏锥虫罗得西亚种(Trypanosomabruceirhodesiense)，媒介为采采蝇(tsetsefly)；其中冈比亚锥虫病占昏睡病报告病例的98％以上，主要见于非洲西部和中部的国家，患者潜伏期较长，可感染数月甚至数年而无明显症状，发现时常常已到疾病晚期，中枢神经系统受累，预后不佳；美洲锥虫病(Americantrypanosomiasis)病原为克氏锥虫(Trypanosomacruzi)，媒介为锥蝽，主要发生于墨西哥以及中南美洲国家，主要临床症状为心脏病、巨食管症和巨结肠症。随着大规模的人口迁移,现已扩散至欧洲、加拿大、澳大利亚、日本以及一些非洲、中东、南亚国家等非流行区。随着国际交流的日益频繁，输入性锥虫病风险增加，需引起重视。目前锥虫病原检测技术主要有血涂片吉姆萨或瑞氏染色镜检，分离培养，PCR检测等方法，但是存在检测时间较长，检测技术难以掌握，灵敏度相对较低等技术问题。其中，克氏锥虫急性期主要依赖于镜下查到锥虫，亦可行PCR检测；血培养、接种诊断法等虽可使用，但耗时较长，隐匿期和慢性期需依赖抗体检测，由于部分检测可能存在交叉反应，需两种免疫学方法检测均为阳性方可确诊，部分病例可行PCR以明确诊断。目前针对锥虫病原检测技术，TomasDuffy等和MariaPiron建立了克氏锥虫的荧光定量PCR检测方法，SvenBeckera建立了布氏锥虫荧光定量PCR检测方法，但是都没有提出锥虫检测通用的荧光定量PCR检测方法。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的锥虫检测技术问题，本专利技术提供一种检测时间更快速、实验操作更简便、特异性与灵敏度强、能广泛应用的锥虫核酸实时荧光PCR检测用引物及试剂盒。本专利技术采用的技术方案为：所述锥虫核酸实时荧光PCR检测用引物是非洲锥虫引物和/或美洲锥虫引物；所述锥虫核酸实时荧光PCR检测用引物是非洲锥虫引物时，所述非洲锥虫引物包括：前引物：GCTAACAGAAGCACTTRGTGAAGTT；后引物：CCGACATGTTGGCTTCAAGA；所述非洲锥虫引物的扩增片段所采用的探针是AACAGGCATATGCTTCT；所述锥虫核酸实时荧光PCR检测用引物是美洲锥虫引物时，所述美洲锥虫引物包括：前引物：AACACAACAACCACACAAAACTACAA；后引物：CCACGCCACTTTTTTTCTTTTTTA；所述美洲锥虫引物的扩增片段所采用的探针是ACTCGCRAGAGATTAA。上述非洲锥虫引物的扩增片段所采用的探针的5’端以及美洲锥虫引物的扩增片段所采用的探针的5’端均含有荧光标记，可以快速的检测出待测样本中的锥虫。进一步的，优选地，上述非洲锥虫引物的扩增片段所采用的探针的荧光标记是FAM；所述美洲锥虫引物的扩增片段所采用的探针荧光标记是HEX。一种锥虫核酸实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述锥虫核酸实时荧光PCR检测试剂盒包括如权利要求1所述的锥虫核酸实时荧光PCR检测用引物。上述的锥虫核酸实时荧光PCR检测试剂盒在检测锥虫核酸时的应用。上述的锥虫核酸实时荧光PCR检测试剂盒在检测非洲锥虫核酸时的应用。上述的锥虫核酸实时荧光PCR检测试剂盒在检测美洲锥虫核酸时的应用。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术提供的锥虫核酸实时荧光PCR检测用引物是非洲锥虫引物和/或美洲锥虫引物；所述锥虫核酸实时荧光PCR检测用引物是非洲锥虫引物时，所述非洲锥虫引物包括：前引物：GCTAACAGAAGCACTTRGTGAAGTT；后引物：CCGACATGTTGGCTTCAAGA；所述非洲锥虫引物的扩增片段所采用的探针是AACAGGCATATGCTTCT；所述锥虫核酸实时荧光PCR检测用引物是美洲锥虫引物时，所述美洲锥虫引物包括：前引物：AACACAACAACCACACAAAACTACAA；后引物：CCACGCCACTTTTTTTCTTTTTTA；所述美洲锥虫引物的扩增片段所采用的探针是ACTCGCRAGAGATTAA，采用非洲锥虫和/或美洲锥虫作为引物进行锥虫核酸实时荧光PCR检测，由于引物具有强的灵敏性以及特异性，实验操作简便，检测速度快。2、本专利技术提供的非洲锥虫引物的扩增片段所采用的探针的5’端以及美洲锥虫引物的扩增片段所采用的探针的5’端均含有荧光标记，所述非洲锥虫引物的扩增片段所采用的探针荧光标记是FAM；所述美洲锥虫引物的扩增片段所采用的探针的荧光标记是HEX。可以快速的识别出待测样本中的锥虫，测试速度快。3、本专利技术采用含有非洲锥虫和/或美洲锥虫的实时荧光PCR检测用引物制成PCR试剂盒，可用于非洲锥虫核酸实时荧光PCR检测，特别是用于非洲锥虫核酸实时荧光PCR检测和美洲锥虫的核酸实时荧光PCR检测，试剂盒具有通用性，因而应用范围广，特别是针对口岸人员流动大的场所，能很好的发现锥虫患者。附图说明图1为本专利技术提供的实施例1中三个不同锥虫样本以及空白样本的灵敏度以及特异性实验曲线示意图；图2为本专利技术提供的实施例2中不同浓度下的非洲锥虫和美洲锥虫样本的检测下限实验曲线示意图；图3为本专利技术提供的实施例3中不同浓度下的非洲锥虫和美洲锥虫样本的重复性实验曲线示意图；图4为本专利技术提供的实施例4中非洲锥虫样本的两种亚型检测能力实验曲线示意图；图5为本专利技术提供的实施例5中不同因素下对锥虫样本的干扰实验曲线示意图；图6为本专利技术提供的实施例6中锥虫样本以及其他样本的盲样检测曲线示意图。具体实施方式现结合附图以及实施例对本专利技术做详细的说明。本专利技术提供的锥虫核酸实时荧光PCR检测用引物，是非洲锥虫引物和/或美洲锥虫引物，具体见表1以及表2所示。表1非洲锥虫核酸实时荧光PCR检测用引物和探针表2美洲锥虫核酸实时荧光PCR检测用引物和探针表1和表2中提供的非洲锥虫以及美洲锥虫具有很强的灵敏性和特异性，且本专利技术提供的非洲锥虫引物的扩增片段所采用的探针的5’端以及美洲锥虫引物的扩增片段所采用的探针的5’端均含有荧光标记，可以快速的检测出待测样本中的非洲锥虫以及美洲锥虫。进一步的，优选地，非洲锥虫引物的扩增片段所采用的探针的荧光标记是FAM；美洲锥虫引物的扩增片段所采用的探针荧光标记是HEX，对检测锥虫的特异性和灵敏度更强。本专利技术提供的锥虫核酸实时荧光PCR检测试剂盒包括含有上述锥虫核酸实时荧光PCR检测用引物。锥虫核酸实时荧光PCR检测试剂盒在检测锥虫核酸时的应用。锥虫核酸实时荧光PCR检测试剂盒在检测非洲锥虫核酸时的应用。锥虫核酸实时荧光PCR检测试剂盒在检测美洲锥虫核酸时的应用。实施例1特异性与灵敏度实验分别提取锥虫(3份)、钩端螺旋体(2份)、丝虫(2份)、健康人血液(2份)、健康人尿液(2份)的核酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种锥虫核酸实时荧光PCR检测用引物，其特征在于：所述锥虫核酸实时荧光PCR检测用引物是非洲锥虫引物和/或美洲锥虫引物；所述锥虫核酸实时荧光PCR检测用引物是非洲锥虫引物时，所述非洲锥虫引物包括：前引物：GCTAACAGAAGCACTTRGTGAAGTT；后引物：CCGACATGTTGGCTTCAAGA；所述非洲锥虫引物的扩增片段所采用的探针是AACAGGCATATGCTTCT；所述锥虫核酸实时荧光PCR检测用引物是美洲锥虫引物时，所述美洲锥虫引物包括：前引物：AACACAACAACCACACAAAACTACAA；后引物：CCACGCCACTTTTTTTCTTTTTTA；所述美洲锥虫引物的扩增片段所采用的探针是ACTCGCRAGAGATTAA。

【技术特征摘要】
1.一种锥虫核酸实时荧光PCR检测用引物，其特征在于：所述锥虫核酸实时荧光PCR检测用引物是非洲锥虫引物和/或美洲锥虫引物；所述锥虫核酸实时荧光PCR检测用引物是非洲锥虫引物时，所述非洲锥虫引物包括：前引物：GCTAACAGAAGCACTTRGTGAAGTT；后引物：CCGACATGTTGGCTTCAAGA；所述非洲锥虫引物的扩增片段所采用的探针是AACAGGCATATGCTTCT；所述锥虫核酸实时荧光PCR检测用引物是美洲锥虫引物时，所述美洲锥虫引物包括：前引物：AACACAACAACCACACAAAACTACAA；后引物：CCACGCCACTTTTTTTCTTTTTTA；所述美洲锥虫引物的扩增片段所采用的探针是ACTCGCRAGAGATTAA。2.如权利要求1所述的锥虫核酸实时荧光PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘永杰，王渊，金子懿，付强，
申请(专利权)人：陕西国际旅行卫生保健中心，
类型：发明
国别省市：陕西,61