一种用于检测羊吕氏泰勒虫的PCR引物、检测试剂及检测方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测羊吕氏泰勒虫的荧光定量PCR检测引物、试剂及检测方法。该PCR引物的上游引物如SEQ ID NO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术所述引物特异性强、灵敏度高、扩增假阳性率低，可实现吕氏泰勒虫的快速、精准检测。

A PCR Primer, Detection Reagent and Detection Method for Detection of Tyler Luciferi in Sheep

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测羊吕氏泰勒虫的PCR引物、检测试剂及检测方法
本专利技术涉及分子生物学领域，特别涉及一种用于检测羊吕氏泰勒虫的实时荧光PCR引物、检测试剂及检测方法。
技术介绍
吕氏泰勒虫是以血蜱为传播媒介的，寄生于绵羊和山羊等动物的巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞内的泰勒科泰勒属的一种血液性原虫。可引起羊泰勒虫病，该病在我国广泛分布，尤其是我国北方地区，主要呈地方性流行，能引起绵羊和山羊的大批死亡，给我国养羊业造成重大的经济损失。其畜牧业的危害较大。病羊通常存在个体消瘦，精神萎靡，体表淋巴结(肩前和腹股沟浅淋巴结)普遍肿大，触摸时有痛感。可视粘膜或薄软皮肤处都可能伴随有出血点，高热等症状。血涂片检查能检测到大量的梨形虫体和裂殖体。目前，吕氏泰勒虫的临床诊断主要的方法是直接镜检、血清学诊断(酶联免疫吸附实验和间接免疫荧光试验)和常规PCR检测等。直接镜检只能用于对发病动物的检测，且对操作者的经验要求高，并且不便于对疫情的普查；血清学诊断存在假阳性的问题。常规PCR检测技术虽然较为常用，但也存在灵敏性较低，易出现漏检的现象。SYBRGreenI实时荧光PCR使用一对特异性引物和SYBRGreenI核酸染料，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，无需电泳，实现快速灵敏地定量检测的目的。但目前缺乏特异性检测羊吕氏泰勒虫的实时荧光定量PCR引物。
技术实现思路
针对现有PCR检测技术特异性低和灵敏性低，吕氏泰勒虫含量较低时容易漏检的缺陷，本专利技术提供了用于检测羊吕氏泰勒虫的PCR引物、检测试剂及检测方法。该PCR引物及检测方法特异性强、敏感性高、漏检率低，可实现吕氏泰勒虫的快速、精准检测。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供一种用于羊吕氏泰勒虫的SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测引物，其上游引物如SEQIDNO:1所示，下游引物如SEQIDNO:2所示。本申请选择吕氏泰勒虫18SrDNA基因的一段特异性区域作为靶序列，设计了2条特异性引物，T.lu-18s-RT-F：5＇-CCAGCTCCAATAGCGTAT-3＇(如SEQIDNO:1所示)，T.lu-18s-RT-R：5′-AAGCCACAATACACCAAC-3＇(如SEQIDNO:2所示)，扩增的目标片段长103bp。与公开专利中提及的环形泰勒虫引物相比，该引物能特异性扩增吕氏泰勒虫片段，而不能检测出环形泰勒虫，具有较好的特异性；与吕氏泰勒虫其它区域设计的引物相比，尽管二者都可以检测到吕氏泰勒虫，但是本专利技术引物灵敏度更高。实验表明，该PCR引物与其他区域设计的引物相比具有特异性强、敏感性高、漏检率低的优势。其中，18SrDNA基因即编码18S核糖体RNA(rRNA)分子的基因。本专利技术还提供了所述PCR引物在制备羊吕氏泰勒虫的检测试剂中的应用。其中，所述检测试剂为实时荧光检测试剂。本专利技术还提供了用于检测羊吕氏泰勒虫的实时荧光检测试剂，包括上述PCR引物。一些实施方案中，所述实时荧光检测试剂还包括FastStartTaqDNA聚合酶、dNTPs、反应缓冲液、SYBRGreenI荧光染料和水。一些实施方案中，所述实时荧光检测试剂还包括阴性对照品和阳性对照品；所述阴性对照品为水，所述阳性对照品为包含羊吕氏泰勒虫18SrRNA基因的重组质粒。本专利技术还提供一种羊吕氏泰勒虫的检测方法，用所述PCR引物对羊吕氏泰勒虫的基因组DNA进行实时荧光PCR扩增。一些实施方案中，所述实时荧光PCR扩增的程序为：95℃预变性10min；95℃保持10sec，62℃10sec，72℃保持15sec为一个循环；共45个循环；反应结束后先加热至95℃，再降至65℃，然后以每秒1％的递增至95℃直至检测荧光信号得出扩增产物的熔解曲线。一些实施方案中，所述实时荧光PCR扩增的体系为：2μL羊血液样品基因组DNA，10μLFastStartEssentialDNAGreenMaster(2×)，1.2μL0.6μM的上游引物，1.2μL0.6μM的下游引物，5.6μLddH2O。本专利技术提供的用于检测羊吕氏泰勒虫的PCR引物、检测试剂及检测方法针对吕氏泰勒虫16SrDNA基因的特异性区域，设计了2条特异性引物，上游引物如SEQIDNO:1所示，下游引物如SEQIDNO:2所示。实验表明，本专利技术提供的PCR引物及检测方法特异性强、敏感性高、漏检率低，可实现吕氏泰勒虫的快速、精准检测。本专利技术提供的检测方法简便快捷，特异性及敏感性均较高，微量基因组DNA即可作为模板进行鉴定(最低能检测到1.35×10-6ng的标准质粒)，应用前景广阔。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示不同引物对吕氏泰勒虫基因组DNA的扩增曲线，曲线1～3依次为引物T.lu18s-RT、引物Tluw310/374、引物Tasm的扩增结果；图2示不同引物扩增的熔解曲线，曲线1～3依次为引物T.lu18s-RT、引物Tluw310/374、引物Tasm的结果；图3示T.lu18s-RT引物实时荧光定量PCR方法的扩增曲线，扩增曲线1～7对应的模板是含有吕氏泰勒虫靶基因片段的质粒，浓度依次为1.35×10-6ng、1.35×10-5ng、1.35×10-4ng、1.35×10-3ng、1.35×10-2ng、1.35×10-1ng、1.35ng；图4示T.lu18s-RT引物实时荧光定量PCR方法的标准曲线，横坐标表示质粒的不同浓度的对数值，纵坐标表示不同浓度质粒扩增的循环数Ct值。具体实施方式本专利技术公开了用于检测羊吕氏泰勒虫的PCR引物、检测试剂及检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术提供的用于检测羊吕氏泰勒虫的PCR引物、检测试剂及检测方法中所用原料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本专利技术：实施例1SYBRGreenI实时荧光PCR检测试剂盒包括：(1)FastStartEssentialDNAGreenMaster(2x)(含有SYBRGreenI化学荧光)(2)引物T.lu-18s-RT-F和T.lu-18s-RT-R。引物T.lu-18s-RT-F和T.lu-18s-RT-R分别是按下述碱基序列由公司合成的DNA片段：T.lu-18s-RT-F：5′-CCAGCTCCAATAGCGTAT-3＇；T.lu-18s-RT-R：5′-AAGCCACAATACACCAAC-3＇。(3)阳性对照：由本实验室构建的含有目的基因片段的重组质粒。通过将扩增获得的吕氏泰勒虫18SrRNA基因103bp片段克隆至pMD18-T并转化DH5-α感受态细胞，经酶切鉴定及测序后获得阳性重组质粒。(4)阴性对照，为超纯水(ddH2O)；检测方法：(1)待测样本的DNA提取：取羊的血液，用商品化的DNA提取试剂盒提取基因组DNA，-20℃保本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PCR引物，其特征在于，其上游引物如SEQ ID NO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2所示。

【技术特征摘要】
1.一种PCR引物，其特征在于，其上游引物如SEQIDNO:1所示，下游引物如SEQIDNO:2所示。2.权利要求1所述的PCR引物在制备羊吕氏泰勒虫的检测试剂中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为实时荧光检测试剂。4.一种用于检测羊吕氏泰勒虫的实时荧光检测试剂，其特征在于，包括权利要求1所述的PCR引物。5.根据权利要求4所述的实时荧光检测试剂，其特征在于，还包括FastStartTaqDNA聚合酶、dNTPs、反应缓冲液、SYBRGreenI荧光染料和水。6.根据权利要求4所述的实时荧光检测试剂，其特征在于，还包括阴性对照品和阳性对照品；所述阴性对照品为水，所述阳性对照品为包含羊吕氏泰勒虫18SrRNA基因的重组质粒。7.一种羊吕氏泰勒虫的检测方法，其特征在于，用权利要求1所述的PCR引物对待测样品的基因组DNA进行实时荧光PCR扩增。8.根据权利要求7所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖承红，杨璐，韩谦，王金花，赵建国，黄良圆，陈静，李妙珍，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：海南,46