一种检测结肠小袋纤毛虫的PCR引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测结肠小袋纤毛虫的PCR引物、试剂盒及方法，属于生物化学与分子生物学领域。该PCR引物为：xmc‑F CAAGTTTCTGCCCTATCATGC，xmc‑R TAAGTTTCAGTCTTGCGACCA。检测试剂盒包括PCR引物，并用于快速检测结肠小袋纤毛虫。检测方法包括：(1)提取待检样品的DNA；(2)PCR反应体系建立；(3)对待检样品进行PCR反应检测；(4)对PCR扩增产物进行电泳及测序。本发明专利技术的方法可实时监测反应，快速检测，具有特异性强等优点，为简便、快速地检测结肠小袋纤毛虫带来便利。

A PCR Primer, Kit and Method for Detecting Colonic Bactria

【技术实现步骤摘要】
一种检测结肠小袋纤毛虫的PCR引物、试剂盒及方法
本专利技术属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种检测结肠小袋纤毛虫的PCR引物、试剂盒及方法。
技术介绍
结肠小袋纤毛虫是引起痢疾的重要原因，特别是在免疫系统受损的人群中，结肠小袋纤毛虫可能成为一种重要的病原体。结肠小袋纤毛虫(balantidiumcoli)寄生于宿主结肠，感染引起结肠小袋纤毛虫病，呈世界性分布，主要流行于热带和亚热带地区。目前已知包括人在内的多种动物如猪、猩猩、猴、大鼠、豚鼠、马、牛、羊、鸵鸟、鹰等均可感染，感染的范围从无症状、轻微腹泻到血粪和暴发性痢疾。自1857年Malmsten首次在两名痢疾病人的粪便中发现以来，该病已给人和动物的健康带来了严重的影响，同时也造成了巨大的经济损失。比如食蟹猴等动物被结肠小袋纤毛虫感染，不仅给养殖业带来经济损失，还严重影响动物质量和动物跟踪研究检测结果的准确性，同时威胁动物饲养人员、兽医工作者及相关密切接触人群身体健康，因此快速准确地检测出结肠小袋纤毛虫感染情况，及时控制清除病原，保持动物的清洁，具有重要的公共卫生意义和研究意义。目前用于实验动物结肠小袋纤毛虫的检测还是采用粪便涂片或沉淀染色法等传统检测手段，这些方法虽然要求设备仪器不高，但由于虫体体积较小，常常受杂质影响较大，显微镜检查时检出率较低；染色法需要配制试剂种类多，步骤繁琐，要求显微镜操作者非常熟悉各类原虫及卵囊形态，具有超强辨别能力和较好的视力，否则受人为因素影响较大。对于大批量的样品检测，需要大量的人力物力，特别是显微镜观察者眼睛极易疲劳，难以在短时间内完成大量检测样品的工作。特别是结肠小袋纤毛虫滋养体在离体粪便样品中处于外界极端环境条件下或染液中极易死亡、变形、甚至溶解，严重影响检测结果的准确度，曾在实验中出现过采样当天采用粪便直接涂片检测发现大量结肠小袋纤毛虫滋养体，第二天重复检测样品却一个都没发现的情况。结肠小袋纤毛虫滋养体这一脆弱性，促使样品检测工作者必须在采样当天拿到样品并检测完成，如远途送样不能及时或样品数量过多拖延至第二天，则难以确保结果的准确性，极有可能造成假阴性，造成阳性动物在群体中隐性传染，导致严重损失，可见在涂片或沉淀染色法等传统检测手段中对样品保存条件十分苛刻。因此利用现代分子生物学知识和仪器设备研究开发新的快速检测结肠小袋纤毛虫方法，制定出操作规程或标准，非常迫切。而PCR方法具有灵敏性高、特异性好、反应时间短及不受样本保存条件影响等优势，可在早期预防控制疾病扩散中发挥重要作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测结肠小袋纤毛虫的PCR引物、试剂盒及方法。本专利技术提供一种PCR引物，并构建试剂盒，能够快速、实时检测，为基层提供更为简便、快捷、准确地检测结肠小袋纤毛虫的方法。本专利技术通过以下技术方案来实现：一种检测结肠小袋纤毛虫的PCR引物，包括以下PCR引物：xmc-FCAAGTTTCTGCCCTATCATGCxmc-RTAAGTTTCAGTCTTGCGACCA。本专利技术的检测结肠小袋纤毛虫的PCR引物扩增片段为18SrRNA，扩增长度为730bp。本专利技术的检测结肠小袋纤毛虫的试剂盒，包括上述的PCR引物。一种检测结肠小袋纤毛虫的非疾病诊断目的的方法，采用上述的PCR引物检测结肠小袋纤毛虫。本专利技术的检测结肠小袋纤毛虫的非疾病诊断目的的方法，包括如下步骤：(1)提取待检样品的DNA。(2)PCR反应体系建立：以每25μl体积的PCR反应体系为计，(3)对待检样品进行PCR反应检测。(4)对PCR扩增产物进行电泳及测序。上述提取待检样品的DNA是按照粪便基因组DNA提取试剂盒提取待检样品的DNA。步骤(1)的具体操作步骤为：①取100-300mg离体粪便样本，置于离心管中，加入1mLBufferSW，涡旋振荡3-5min使样本均匀分散于溶液中，再以12000rpm的转速离心1min，弃掉上清液；②往离心管中加入1mLBufferSL，涡旋振荡3-5min使样本均匀分散于溶液中，置于65℃水浴中20min并每隔5min涡旋振荡15s，然后以12000rpm的转速离心5min，将上清液移至干净的离心管中；③向步骤②得到的上清液中加入等体积的BufferGL，颠倒混匀15-25次，然后置于冰上放置5min，再以12000rpm的转速离心5min，保留上清液；④将吸附柱装入收集管中，然后将步骤③得到的上清液加入吸附柱中，以12000rpm的转速离心1min，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱重新放回收集管中；⑤向吸附柱中加入500μLBufferGW1(使用前检查是否加入无水乙醇)，以12000rpm的转速离心1min，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱重新放回收集管中；⑥向吸附柱中加入500μLBufferGW2(使用前检查是否加入无水乙醇)，以12000rpm的转速离心1min，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱重新放回收集管中；⑦重复步骤⑥；⑧以12000rpm的转速离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温下晾干；⑨将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空滴加50-100μLBufferGE，室温放置2-5min，再以12000rpm的转速离心1min，即得到DNA溶液。作为技术方案的优选，所述PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性45s，59-68℃退火1min，72℃延伸1min；如此循环35次后，72℃再延伸10min。作为技术方案的进一步优选，所述PCR反应的最佳退火温度为63-65℃。作为技术方案的优选，将PCR扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，然后将有目的条带的PCR扩增产物进行胶回收、克隆和测序，准确后进行提取质粒。本专利技术的PCR引物在制备检测结肠小袋纤毛虫的试剂盒中的运用。本专利技术根据GeneBank中已经发表的结肠小袋纤毛虫序列，选定其中的基因18SrRNA经过筛选，设计并合成一对特异性引物(xmc-F、xmc-R)，以结肠小袋纤毛虫的DNA为模板进行PCR扩增，得到730bp的与预期大小相符的特异性条带，扩增产物经凝胶回收后进行测序，序列测定结果与已发表18SrRNA片段进行比较，同源性达100％，没有发现变异现象。结果判定：本专利技术的PCR引物(xmc-F、xmc-R)有扩增产物730bp，核苷酸序如序列表所示。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术的引物用于结肠小袋纤毛虫检测的特异性良好，对模板的纯度要求不高，DNA或RNA粗制品均可作为模板，经PCR检测只有纤毛虫有条带，其他没有条带。(2)本专利技术的引物用于结肠小袋纤毛虫检测的敏感性较好，粪便抽提DNA含量低至4.205×10-5ng/μL时仍然能检测到。(3)本专利技术的引物用于结肠小袋纤毛虫检测一般2-3h可完成，相比其他引物更加省时。(4)已有实验证明PCR扩增长度在500-1000bp之间比较容易操作，碱基错配率较低，条带容易分辩，并为后续的LAMP检测方法做铺垫。本专利技术的引物用于结肠小袋纤毛虫检测的PCR扩增产物片段为730bp，可操作性好，碱基错配率低，条带容易分辩。(5)本专利技术的引物用于结肠小袋纤毛虫检测的PCR扩增的退火温度选择范围较宽，在59-68℃均可出现特异性扩增条带，特别是在退火温度为63本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测结肠小袋纤毛虫的PCR引物，其特征在于，包括以下PCR引物：xmc‑F CAAGTTTCTGCCCTATCATGCxmc‑R TAAGTTTCAGTCTTGCGACCA。

【技术特征摘要】
1.一种检测结肠小袋纤毛虫的PCR引物，其特征在于，包括以下PCR引物：xmc-FCAAGTTTCTGCCCTATCATGCxmc-RTAAGTTTCAGTCTTGCGACCA。2.根据权利要求1所述的检测结肠小袋纤毛虫的PCR引物，其特征在于，所述PCR引物扩增片段为18SrRNA，扩增长度为730bp。3.一种检测结肠小袋纤毛虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的PCR引物。4.一种检测结肠小袋纤毛虫的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，所述方法采用如权利要求1-3任一所述的PCR引物检测结肠小袋纤毛虫。5.根据权利要求4所述的检测结肠小袋纤毛虫的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取待检样品的DNA；(2)PCR反应体系建立：以每25μl体积的PCR反应体系为计...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢永平，贺会利，庞彬辉，李军，潘艳，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：广西,45