一种用于鉴定牛瑟氏泰勒焦虫的引物组合及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于鉴定牛瑟氏泰勒焦虫的引物组合，属于分子生物学领域。该引物组合包括具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物。本发明专利技术还公开了包含该引物组合的试剂盒和相应的鉴定牛瑟氏泰勒焦虫的方法。本发明专利技术利用主要表面蛋白（MPSP）基因设计引物，为瑟氏泰勒焦虫的鉴定提供了一种全新的选择，扩增得到的序列与NCBI数据库中瑟氏泰勒焦虫序列的同源性更高，可以进行针对性地治疗，更加高效地防治泰勒焦虫感染。

A Primer Combination for Identification of Cow Thaler Coke and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种用于鉴定牛瑟氏泰勒焦虫的引物组合及其应用
本专利技术属于分子生物学领域，具体地，涉及一种用于鉴定牛瑟氏泰勒焦虫的引物组合及其应用。
技术介绍
牛泰勒虫病是由泰勒科(Theileriidae)泰勒属(Theileria)的原虫所引起的一种血液原虫病，泰勒虫主要侵袭牛的淋巴细胞和红细胞，患病的牛表现高热、贫血、黄疸、体表淋巴结肿大等临床症状，严重时可导致牛的死亡，对养牛产业带来损失。中国目前报道感染牛的泰勒虫共有三种，环形泰勒虫、中华泰勒虫和瑟氏泰勒虫，其中环形泰勒虫致病性最强，而瑟氏泰勒虫分布最广。牛的瑟氏泰勒虫病最早在韩国、日本出现，后来在中国也发现该病原，感染牛临床症状较环形泰勒虫感染轻，患牛表现精神不振、发热、贫血和淋巴结肿胀。目前对于泰勒焦虫的研究主要集中在环形泰勒焦虫的研究上，在泰勒焦虫的鉴定方面，除了分子生物学方法以外还有间接ELISA方法的建立和研究，有些流行病学调查研究一般只鉴定到泰勒焦虫属，因此国内对瑟氏泰勒焦虫的分子生物学研究较少。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，专利技术人根据NCBI数据库中的瑟氏泰勒焦虫MF996372.1序列主要表面蛋白(MPSP)基因设计了引物，出乎意料地发现，扩增后测得的序列经过NCBI数据库BLAST比对后显示与瑟氏泰勒焦虫的同源性达到99％，可以准确和快速的鉴定牛瑟氏泰勒焦虫，从而完成本专利技术。本专利技术第一方面提供一种用于鉴定牛瑟氏泰勒焦虫的引物组合，包括具有SEQIDNO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO.2所示核苷酸序列的下游引物。在本专利技术中，所述引物组合用于扩增MPSP基因，该基因编码的蛋白是泰勒属的保守蛋白。本专利技术的第二方面提供本专利技术第一方面所述的引物组合在制备用于鉴定牛瑟氏泰勒焦虫的试剂盒中的应用。本专利技术的第三方面提供一种用于鉴定牛瑟氏泰勒焦虫的试剂盒，包括本专利技术第一方面所述的引物组合。在本专利技术的一些优选实施方案中，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液。在本专利技术的另一些优选实施方案中，所述试剂盒还包括阳性对照样本。在本专利技术的一些更优选实施方案中，所述阳性对照样本为已知牛瑟氏泰勒焦虫的MPSP基因序列。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述已知牛瑟氏泰勒焦虫的MPSP基因序列具有SEQIDNO.3所示核苷酸序列。本专利技术的第四方面提供一种鉴定牛瑟氏泰勒焦虫的方法，包括以下步骤：(1)获得样本；(2)提取所述样本的DNA样本；(3)利用权利要求1所述的引物组合对步骤(2)所述DNA样本进行PCR扩增；(4)利用凝胶电泳检测步骤(3)PCR扩增得到的PCR产物，如果PCR产物检测到目标条带，则判定所述样本牛瑟氏泰勒焦虫阳性。进一步地，所述目标条带大小约492bp。在本专利技术的一些实施方案中，步骤(3)中PCR扩增体系包括：模板0.1-0.5μL，上下游引物各0.1-0.5μL，2×DNAmastermix10μL，ddH2O9μL。在本专利技术的一些优选实施方案中，模板0.3μL。在本专利技术的另一些优选实施方案中，引物各0.2-0.5μL；在本专利技术的一些更优选实施方案中，引物和0.3μL。在本专利技术的一些实施方案中，步骤(3)中PCR扩增程序包括：94℃变性45s，退火温度56-64℃，72℃延伸30-120s，35个循环；72℃再延伸10min；4℃保存。在本专利技术的一些优选实施方案中，退火温度为56、58、60、62、64℃。在本专利技术的一些更优选实施方案中，退火温度为64℃。在本专利技术的一些优选实施方案中，延伸申请为50-90s，例如50、60、90s。在本专利技术的一些实施方案中，所述方法进一步包括将检测到目标条带的PCR产物进行测序的步骤。进一步地，如果测序结果与已知牛瑟氏泰勒焦虫相应序列的相似性超过99％，则判定所述样本牛瑟氏泰勒焦虫阳性。本专利技术的有益效果相对于现有技术，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术利用主要表面蛋白(MPSP)基因设计引物，为瑟氏泰勒焦虫的鉴定提供了一种全新的选择。本专利技术的方法还进一步优化了引物最佳的PCR扩增体系(如PCR扩增过程中引物的加入量、模板的加入量)和最佳的PCR扩增条件(扩增过程中退火温度和延伸时间的设置)，扩增效果更好。利用本专利技术的引物组合扩增得到的序列与NCBI数据库中瑟氏泰勒焦虫序列的同源性更高。利用本专利技术进行鉴定，可以根据鉴定结果，针对不同虫种的感染进行针对性地治疗，更加高效地防治泰勒焦虫感染。附图说明图1示出了最佳退火温度优化结果。M(marker)，1(56℃)，2(58℃)，3(60℃)，4(62℃)，5(64℃)。图2示出了最佳延伸时间的优化结果。M(marker)，1(30s)，2(50s)，3(60s)，4(120s)。图3示出了最佳扩增模板量的优化结果。M(marker)，1(0.1μL)，2(0.2μL)，3(0.3μL)，4(0.4μL)，5(0.5μL)。图4示出了最佳扩增引物量的优化结果。M(marker)，1(0.1μL)，2(0.2μL)，3(0.3μL)，4(0.4μL)，5(0.5μL)。图5示出了本专利技术扩增结果系统进化树分析结果。图6示出了利用本专利技术的引物对鉴定未知泰勒焦虫的结果。M(marker)。具体实施方式为了使本专利技术所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。实施例以下例子在此用于示范本专利技术的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表专利技术人发现的可以用于实施本专利技术的技术，因此可以视为实施本专利技术的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本专利技术的精神或范围。除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本专利技术所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的专利技术的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例1引物设计根据NCBI数据库中的瑟氏泰勒焦虫MF996372.1序列主要表面蛋白(MPSP)基因设计引物：上游：5'-TCGCCCACAGAATGAAGCAT-3'(SEQIDNO.1)下游：5'-CCAAAGGCCAAGCACTGTTC-3'(SEQIDNO.2)引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物稀释后浓度为0.5μmol/L。实施例2扩增体系和程序优化1.最佳退火温度研究PCR扩增体系：模板(200ng/μL，0.4μL)，上下游引物(各0.3μL)，2×DNAmastermix(10μL)，ddH2O(9μL)。PCR扩增条件：94℃变性45s，退火温度分别设置(56℃、58℃、60℃、62℃、64℃)，72℃延伸60s，35个循环；72℃再延伸10min；4℃保存。结果如图1所示，在不同的退火温度下扩增目的序列，在64℃时扩增结果最好，条带单一明本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鉴定牛瑟氏泰勒焦虫的引物组合，其特征在于，包括具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物。

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定牛瑟氏泰勒焦虫的引物组合，其特征在于，包括具有SEQIDNO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO.2所示核苷酸序列的下游引物。2.权利要求1所述的引物组合在制备用于鉴定牛瑟氏泰勒焦虫的试剂盒中的应用。3.一种用于鉴定牛瑟氏泰勒焦虫的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组合。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液。5.一种鉴定牛瑟氏泰勒焦虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获得样本；(2)提取所述样本的DNA样本；(3)利用权利要求1所述的引物组合对步骤(2)所述DNA样本进行PCR扩增；(4)利用凝胶电泳检测步骤(3)PCR扩增得到的PCR产物，如果PCR产物检测到目标条带，则判定所述样本牛瑟氏泰勒焦虫阳性。6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐雨，图雅，邹勇，冯明祥，韦登雄，
申请(专利权)人：关岭布依族苗族自治县畜牧服务中心，
类型：发明
国别省市：贵州,52