利用细胞色素基因检测蛇毒种属来源的方法技术

本发明专利技术涉及生物领域，具体提供了一种利用细胞色素基因检测蛇毒种属来源的方法。本发明专利技术所述方法包括1)引物设计：以NCBI数据库中记载的蛇细胞色素B基因为参考序列并进行同源性分析；在相对保守区设计引物。2)PCR扩增：以从蛇毒样品中提取的DNA为模板进行扩增，对PCR产物进行测序；3)BLAST对比：将获得的序列去除两端引物，然后进行BLAST对比找出NCBI数据库中与扩增部分Cytb序列相同的序列，从而确定出蛇毒种属。本发明专利技术具有耗时短、准确度高、成本低、操作性强的优点，有效解决本领域蛇毒种属检测来源的技术难题。

A method of detecting the origin of snake venom by cytochrome gene

【技术实现步骤摘要】
利用细胞色素基因检测蛇毒种属来源的方法
本专利技术涉及生物领域，提供了一种蛇毒检测的方法，具体为利用细胞色素基因检测蛇毒种属来源的方法。
技术介绍
蛇是四肢退化的爬行动物的总称，属于爬行纲有鳞目中的蛇亚目。目前全球总共有3,000多种蛇类，其中毒蛇有大约有600多种。我国的蛇类资源丰富，约有200多种，其中毒蛇约为48种，但具有剧毒的蛇类仅有大约10多种。蛇毒是从毒蛇头部两侧眼后下方的毒腺中分泌出来的一种毒液，其经排毒导管进入毒牙鞘内，经毒牙挤压入伤者体内，然后随血液和淋巴扩散而引起伤者出现中毒症状。蛇毒的成分十分复杂，主要为蛋白质(约占90％～95％)，可分为酶、神经毒性多肽、神经生长因子、膜活性多肽和其他生物活性肽等5类。近年来，随着毒理学、药理学、生物化学、分子生物学、分子遗传学和蛋白组学的发展，多种蛇毒的生化组分已经得到分离纯化，并且在蛇毒的促凝、溶栓、镇痛、降压和抗肿瘤等方面进行了比较深入的研究。结果表明蛇毒在医药领域中具有很大的利用价值，是极为珍贵的药物原料。由于不同的毒蛇分泌不同性质的蛇毒，即使是同种毒蛇，如果在不同的产地，也可能在蛇毒成分上存在一些差异，所以蛇毒的种属鉴定，即判定蛇毒来源于哪种毒蛇，无论是在临床诊断与救治、法医工作和蛇毒有效成分生产方面均具有重要意义。蛇毒种类检测方法包括早期的凝聚测试法、免疫电泳法、放射免疫法和酶联免疫吸附法，到近期的聚合酶链反应、荧光免疫法、广谱免疫法等等。其中聚合酶链反应法(polymerasechainreaction,PCR)是一种体外扩大和扩增特定DNA片段和RNA片段的技术。Suntrarachun等人(SuntrarachunS,PakmaneeN,TirawatnapongT,etat.De-velopmentofapolymerasechainreactiontodistinguishmonocellatecobra(Najakhouthia)bitesfromothercommonThaisnakespecies,usingbothvenomextractsandbite-siteswabs[J].Toxicon,2001,39(7)：1087-1090)首次采用PCR方法鉴定蛇伤，但是鉴于鉴定结果的准确性问题，其并没有将这一技术完善成可供实际蛇伤案件适用的方法。该方法在进行特异性引物设计过程中仅参考中国眼镜蛇的毒素基因进行设计，利用所设计的引物在其他环蛇、蝰蛇及眼镜王蛇中扩增，没有得到片段，进而说明利用从蛇咬伤伤口处得到的毒素可以对蛇种进行鉴定。引物设计不全面，忽略地域差异。CN201110152346.X公开了一种利用适配子技术检测鉴别蛇毒种类的方法，该方法筛选具有高度蛇毒种属特异性的适配子，并将适配子转为报告适配子建立蛇毒快速检测新方法。该方法使用蛇毒范围较窄，过程复杂，不易操作，不适合常规的检验操作。由于蛇毒属于动物机体的分泌物，没有真正意义上的细胞组织，并且蛇毒价格昂贵，因此开发基于DNA聚合酶联扩增(PCR)的蛇毒种属来源及纯度鉴定方法也是本领域的重点研究方向。
技术实现思路
针对以上技术现状，本专利技术提供这一种利用特性分子遗传标记检测蛇毒种属来源的方法。所述方法包括如下步骤：1)引物设计：以NCBI数据库中记载的蛇细胞色素B基因为参考序列并进行同源性分析，在相对保守区设计引物；2)PCR扩增：以从蛇毒样品中提取的DNA为模板进行扩增，对PCR产物进行测序；3)BLAST对比：将获得的序列去除两端引物，然后进行BLAST对比找出NCBI数据库中与扩增部分的细胞色素B基因(Cytb)序列相同的序列，从而确定出蛇毒种属。本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述步骤1)中的引物为SEQIDNO：1所示序列的引物S-Cytb-F1、SEQIDNO：2所示序列的引物S-Cytb-F2、SEQIDNO：3所示序列的引物S-Cytb-R1、SEQIDNO：4所示序列的引物S-Cytb-R2，或它们中两种的组合物。本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述步骤2)中的PCR反应体系为20μL：2×PCRmix10μL、上游和下游引物各0.5μL(25pmol)、DNA1μL，ddH2O8μL。本专利技术方法中，作为实施方案之一，PCR扩增条件为：95℃预变性2～3分钟，94℃变性20～30秒，55～60℃退火30秒，72℃延伸40秒，30～35个循环；最后72℃延伸1分钟。本专利技术方法中，作为实施方案之一，PCR扩增条件为：95℃预变性3分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，35个循环；最后72℃延伸1分钟。本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述步骤2)中可选择地进一步包括PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后，再进行测序。本专利技术方法中，所述1.5％琼脂糖电泳检测并非必须条件，1.5％琼脂糖电泳检测的目的是防止PCR扩增过程不稳定情况下无法得到DNA检测条带，进而导致测序无意义，如若能保证前面扩增过程稳定，则可以直接测序。本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述蛇种属包括但不限于江浙蝮蛇、白眉蝮蛇、烙铁头蛇、银环蛇、黑眉蝮蛇、尖吻蝮蛇、蝰蛇或美洲矛头蝮蛇的蛇毒种属的检测。其中所述江浙蝮蛇来源于短尾蝮蛇(Gloydiusbrevicaudus)，属于爬行纲(Reptilia)有鳞目(Squamata)蛇亚目(Serpentes)蝰科(Viperidae)亚洲蝮属(Gloydius)，是中国南北广为分布的一种剧毒蛇，别名有土地婆、七寸子、土蝮蛇、土夫蛇、土公蛇等。短尾蝮分布广、数量多、毒性较强。长期以来短尾蝮被用以生产蛇酒、蛇干、蛇粉以及做原料生产药物等。所述白眉蝮蛇来源于乌苏里蝮蛇(Gloydiusussuriensis)(或称为“乌苏里蝮蛇”)，英文名为UssuriMamushi，属于爬行纲(Reptilia)有鳞目(Squamata)蛇亚目(Serpentes)蝰科(Viperidae)蝮蛇亚科(Crotalinae)亚洲蝮属(Gloydius)，俗名白眉蝮、土球子、草上飞、七寸子。主要分布于辽宁、吉林、黑龙江。国外分布于俄罗斯远东地区和朝鲜。所述烙铁头蛇来源于原矛头蝮，学名为Protobothropsmucrosquamatus，英文名为Pointed-scaledpitviper，属于爬行纲(Reptilia)有鳞目(Squamata)蛇亚目(Serpentes)蝰科(Viperidae)原矛头蝮属，俗名烙铁头、笋壳班、老鼠蛇和恶乌子等。主要生活于丘陵及山区，国内分布较广。医传统理论认为原矛头蝮身体有止痛的功效。所述银环蛇来源于马来环蛇，学名为Bungaruscandidus，属于爬行纲(Reptilia)有鳞目(Squamata)蛇亚目(Serpentes)眼镜蛇科(Elapidae)环蛇属(Bungarus)，为致命的剧毒蛇。上颌骨前端有前沟牙类型毒牙，头椭圆形，瞳孔圆形，身体修长，粗细均匀。背部黑色或黑褐色，有的具黑白或黑黄色的横纹，或者棕褐或棕红色的黑斑和纵线。所述黑眉蝮蛇来源于岩栖蝮(Gloydiussaxatilis)，岩栖蝮属于爬行纲(Reptilia)有鳞目(Squamata)蛇亚目(Serpentes)(V本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛇毒种属来源的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1)引物设计：以NCBI数据库中记载的蛇细胞色素B基因为参考序列并进行同源性分析，在相对保守区设计引物；2)PCR扩增：以从蛇毒样品中提取的DNA为模板进行扩增，对PCR产物进行测序；3)BLAST对比：将获得的序列去除两端引物，然后进行BLAST对比找出NCBI数据库中与扩增部分的蛇细胞色素B基因序列相同的序列，从而确定蛇毒种属。

【技术特征摘要】
1.一种蛇毒种属来源的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1)引物设计：以NCBI数据库中记载的蛇细胞色素B基因为参考序列并进行同源性分析，在相对保守区设计引物；2)PCR扩增：以从蛇毒样品中提取的DNA为模板进行扩增，对PCR产物进行测序；3)BLAST对比：将获得的序列去除两端引物，然后进行BLAST对比找出NCBI数据库中与扩增部分的蛇细胞色素B基因序列相同的序列，从而确定蛇毒种属。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的引物为：SEQIDNO：1所示序列的引物S-Cytb-F1、SEQIDNO：2所示序列的引物S-Cytb-F2、SEQIDNO：3所示序列的引物S-Cytb-R1、SEQIDNO：4所示序列的引物S-Cytb-R2，或它们中的两种组合。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的PCR反应体系为20μL：2×PCRmix10μL、上游和下游引物各0.5μL(25pmol)、DNA1μL，ddH2O8μL。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中PCR扩增条件为：95℃预变性2～3分钟，94℃变性20～30秒，55～60℃退火30秒，72℃延伸40秒，30～35个循环；最后72℃延伸1分钟；优选PCR扩增条件为：95℃预变性3分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，35个循环；最后72℃延伸1分钟。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛇种属包括江浙蝮蛇、白眉蝮蛇、烙铁头蛇、银环蛇、...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂丽，杜宏明，陈珊，靳美霞，刘翠秀，
申请(专利权)人：锦州奥鸿药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21