小牛血清动物源性成分种属的检测方法技术

本发明专利技术属于生化药物检测领域，具体提供一种小牛血清动物源性成分种属的检测方法，所述动物源性成分为牛源性成分、猪源性成分或羊源性成分，所述方法包括：(1)模板DNA制备：提取样品的基因组DNA，测定浓度，稀释，作为样品模板DNA；(2)PCR扩增：取步骤(1)中所得样品模板DNA，鉴别引物为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；或为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；或为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；(3)酶切反应：取步骤(2)所得样品模板DNA扩增产物，限制性内切酶为Dpn II酶、Mnl I酶、或Sau3A I酶；(4)琼脂糖凝胶电泳测定：取步骤(3)所得酶切产物，制胶，点样，电泳。本发明专利技术方法专属性好、灵敏度高、操作简便。操作简便。操作简便。

【技术实现步骤摘要】
小牛血清动物源性成分种属的检测方法


[0001]本专利技术涉及生化药物检测领域，具体涉及一种小牛血清动物源性成分 种属的检测鉴别方法。

技术介绍

[0002]小牛血清去蛋白注射液为小牛血清经乙醇沉淀去蛋白、浓缩、多次超 滤除菌等工艺制得的无菌水溶液。其已收载于国家药品标准中，该标准虽 规定了产品的动物种属来源，但并未提出具体的小牛血清种属来源的检测 鉴别方法。由于在小牛血清去蛋白注射液生产过程中，小牛血清去蛋白提 取物要经多次超滤步骤，本产品的制剂中的活性成分与中间体已不具备通 过核酸分子技术来检测鉴别小牛血清的种属来源的条件，小牛血清由于其 经过了搅拌、离心等多道工序而获得，其模板DNA的含量更低且不易扩增， 因此，如何能够有效检测出不同种属来源的小牛血清，对于鉴别产品是否 符合国家有关的质量要求尤为关键。
[0003]聚合酶链式反应法(Polymerase Chain Reaction，PCR)系指通过提取 样品中物种的遗传物质脱氧核糖核酸(DNA)，对DNA中具有种属特异性 的片段进行聚合酶链式反应扩增，并对扩增产物进行检测，以检测不同种 属来源的动物源性成分产品，常规PCR法采用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增 产物进行检测，通过与DNA分子量Marker进行比较，将样品扩增产物的 片段大小与预期大小进行比较，从而判断样品中是否含有特定的动物源性 成分。
[0004]国家标准GB/T21101
‑
2007公开了动物源性饲料中猪源性成分定性检测 的PCR方法。该方法属于从固体原料中提取DNA，其模板DNA浓度相对 有保证，扩增容易。但是，该方法不适用于药品行业中DNA浓度较低的液 体动物源性原料，且该方法使用试剂复杂，相对于药品检验实验室不易操 作。
[0005]国家标准GB/T 20190
‑
2006公开了饲料中牛羊源性成分定性检测的 PCR方法。该方法同样属于从固体原料中提取DNA，其模板DNA浓度相 对有保证，扩增容易。但该方法不适用于药品行业中DNA浓度较低的液体 动物源性原料，且该方法使用试剂复杂，相对于药品检验实验室不易操作。
[0006]因此，为了有效检测小牛血清去蛋白注射液的小牛血清的种属来源以 确定其是否符合相关质量要求，保证小牛血清原料确实来源于牛源性成分， 亟需一种针对原材料小牛血清的牛、猪及羊源性成分的检测鉴别方法。
[0007]开发一种专属性好、灵敏度高、扩增速度快、操作简便、成本低的小 牛血清动物源性成分种属的检测方法是有必要的。

技术实现思路

[0008]针对以上技术现状，本专利技术的目的是提供一种专属性好、灵敏度高、 操作简便的小牛血清动物源性成分种属的检测方法，本专利技术所述方法包括 如下步骤：
[0009](1)模板DNA制备：提取样品的基因组DNA，测定浓度，稀释，作 为样品模板DNA；
[0010](2)PCR扩增：取步骤(1)中所得样品模板DNA，鉴别引物为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；或为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；或为 SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；PCR扩增反应体系为样品模板DNA、鉴 别引物混合液、PCR扩增试剂、水，扩增条件为：94℃预变性1
‑
5分钟， 然后94
‑
95℃变性30
‑
60秒、50
‑
60℃退火30
‑
45秒、72℃延伸30
‑
60秒，循 环30
‑
35次，72℃延伸5min，4℃保温结束反应；
[0011](3)酶切反应：取步骤(2)所得样品模板DNA扩增产物，限制性内 切酶为Dpn II酶、Mnl I酶、或Sau3A I酶，酶切反应体系为扩增产物、限 制性内切酶、酶反应缓冲液、无菌水，酶切反应条件为：37℃60
‑
120分钟，65℃5
‑
20分钟，4℃保温结束反应；作为示例性的说明，37℃酶切60min、 80min、100min、120min。
[0012](4)琼脂糖凝胶电泳测定：取步骤(3)所得酶切产物，制胶，点样， 电泳。
[0013]本专利技术方法中，所述动物源性成分包括牛源性成分、猪源性成分或羊 源性成分。
[0014]本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述方法步骤(2)中扩增条件为： 94℃预变性3
‑
5分钟，然后94
‑
95℃变性30
‑
45秒、55
‑
59℃退火30秒、72℃ 延伸30
‑
45秒，循环35次，72℃延伸5min，4℃保温结束反应；
[0015]本专利技术方法中，作为实施方案之一，进一步优选扩增条件为：94℃预 变性5分钟，然后94℃变性30秒、57℃退火30秒、72℃延伸30秒，循环 35次，72℃延伸5min，4℃保温结束反应。作为示例性说明，退火温度为 55℃、56℃、57℃、58℃、59℃。
[0016]本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述方法步骤(3)中酶切反应条 件为：37℃60分钟，65℃20分钟，4℃保温结束反应。
[0017]本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括：所述样品 包括对照品和供试品，所述供试品为小牛血清；所述对照品为小牛血清、 猪血清或羊血清。
[0018]本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括：步骤(1) 中提取的DNA用水稀释制成每1ml中含DNA 1.25～5μg的溶液，优选每1ml 中含5μg的溶液。
[0019]本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括：步骤(2) 中PCR扩增试剂为Premix Ex Taq HS、Taq HS Perfect Mix、或Premix Taq
TM
， PCR扩增反应体系为样品模板DNA 5
‑
8μl、优选5μl，鉴别引物混合液 0.5
‑
1μl、优选1μl，扩增试剂10μl、无菌水补足至20μl。
[0020]本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述方法步骤(2)中PCR扩增试 剂为Premix Ex Taq HS，PCR扩增反应体系为样品模板DNA 5μl、鉴别引物 混合液1μl、Premix Ex Taq HS 10μl、无菌水补足至20μl。
[0021]本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述步骤(4)进一步包括：
[0022](4
‑
1)琼脂糖凝胶的配制：称取琼脂糖1.5g，加琼脂糖凝胶电泳缓冲 液50ml，加热使完全溶胀，加入核酸染料5μl，趁热将胶液倾注于制胶板上， 涂层厚度约10mm，插入加样梳，静置，待凝胶凝固成无气泡的均匀薄层， 拔出加样梳，即得；
[0023](4
‑
2)电泳检测：分别取步骤(3)所得供试品和对照品限制性内切酶 酶切反应液各9μl，加本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小牛血清动物源性成分种属的检测方法，其特征在于，所述动物源性成分为牛源性成分、猪源性成分或羊源性成分，所述方法包括如下步骤：(1)模板DNA制备：提取样品的基因组DNA，测定浓度，稀释，作为样品模板DNA；(2)PCR扩增：取步骤(1)中所得样品模板DNA，鉴别引物为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；或为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；或为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；PCR扩增反应体系为样品模板DNA、鉴别引物混合液、PCR扩增试剂、无菌水，扩增条件为：94℃预变性1
‑
5分钟，然后94
‑
95℃变性30
‑
60秒、50
‑
60℃退火30
‑
45秒、72℃延伸30
‑
60秒，循环30
‑
35次，72℃延伸5min，4℃保温结束反应；(3)酶切反应：取步骤(2)所得样品模板DNA扩增产物，限制性内切酶为Dpn II酶、Mnl I酶、或Sau3A I酶；酶切反应体系为扩增产物、限制性内切酶、酶反应缓冲液、无菌水；酶切反应条件为：37℃60
‑
120分钟，65℃5
‑
20分钟，4℃保温结束反应；(4)琼脂糖凝胶电泳测定：取步骤(3)所得酶切产物，制胶，点样，电泳。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法步骤(2)中扩增条件为：94℃预变性3
‑
5分钟，然后94
‑
95℃变性30
‑
45秒、55
‑
59℃退火30秒、72℃延伸30
‑
45秒，循环35次，72℃延伸5min，4℃保温结束反应；进一步优选扩增条件为：94℃预变性5分钟，然后94℃变性30秒、57℃退火30秒、72℃延伸30秒，循环35次，72℃延伸5min，4℃保温结束反应。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法步骤(3)中酶切反应条件为：37℃60分钟，65℃20分钟，4℃保温结束反应。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：所述样品包括对照品和供试品，所述供试品为小牛血清；所述对照品为小牛血清、猪血清或羊血清。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：步骤(1)中提取的DNA用水稀释制成每1ml中含DNA 1.25～5μg的溶液，优选每1ml中含5μg的溶液。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：步骤(2)中PCR扩增试剂为Premix Ex Taq HS、Taq HS Perfect Mix、或Premix Taq
TM
，PCR扩增反应体系为样品模板DNA 5
‑
8μl、优选5μl；鉴别引物混合液0.5
‑
1μl、优选1μl；扩增试剂10μl、无菌水补足至20μl。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜宏明，聂丽，靳美霞，陈珊，刘翠秀，
申请(专利权)人：锦州奥鸿药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：