一种基于超速PCR与功能核酸的可视化检测方法技术

本发明专利技术提供一种基于超速PCR与功能核酸的可视化检测方法，采用优化的超速PCR反应体系进行检测，比传统方法更快捷、更灵敏，具备特异性强、灵敏度高、检测结果可靠等优点，可以简化分析检测步骤，缩短分析时间，更重要的是使长度为600bp

【技术实现步骤摘要】
一种基于超速PCR与功能核酸的可视化检测方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种致病菌长靶标序列的快速比色传感新方法。

技术介绍

[0002]聚合酶链式反应(PCR)作为一种用于放大扩增特定的DNA靶标片段的分子生物学技术，广泛应用于食品安全、环境监测与临床诊断领域。随着检测时效性需求的增加，超速PCR技术应运而生，将数小时的PCR扩增时间减少至数分钟。然而，受制于PCR反应动力学因素，超速PCR技术仅用于扩增较短的靶标序列，对于待测DNA长度较长的靶标无法扩增。
[0003]另外，对于扩增产物的检测，传统的凝胶电泳方法，耗时长、易形成气溶胶污染，电泳所用的化学品对人体危害较大；而实时荧光检测中使用DNA双链荧光嵌入剂，如SYTO9、SYBRGreenI、GelRed等，通过计算Ct值的大小间接表征核酸扩增情况。上述方法均成本较高，耗时长，不利于便捷化使用，其结果不可视，不容易分析。
[0004]本课题组为了解决极速PCR检测的便捷化应用问题，提供了一种超速PCR可视化检测方法(Visual single cell detection of dual-pathogens based on multiplex super PCR (MS-PCR) and asymmetric tailing HCR (AT-HCR), 《Sensors and Actuators B: Chemical》Volume 260, Pages 870-876)，具体为：设计特异性上游引物，并在上游引物的5
’
末端加入修饰有oxyethyleneglycol化学修饰、且能够发生自身互补的接头序列(AGAGAGAGAGAGGGAAAGAGAGAG-oxyethyleneglycol-CTCTCTCTTTCCCTCTCTCTCTC)与间隔序列(TTTTTT)。在超速PCR扩增靶标序列的同时，利用oxyethyleneglycol化学修饰阻断ExTaq DNA聚合酶延伸，使PCR扩增子携带有单链DNA突出末端；而该单链DNA突出末端作为杂交链式反应的激发序列，启动了自组装反应，形成了大量带有3
’
端突出粘性末端的DNA双链结构；进一步，大量存在的3
’
端突出粘性末端作为末端脱氧核酸转移酶的催化位点，形成富含鸟嘌呤G的单链DNA，在氯高铁血红素的诱导下，由末端脱氧核酸转移酶催化形成富G单链组装形成G-四联体，发挥辣根过氧化物酶活性，完成显色。即采用“超速PCR扩增-杂交链式反应-末端脱氧核酸转移酶-G-四联体显色”的4个环节完成超速PCR并显色。
[0005]但上述技术仍有可以改进之处。

技术实现思路

[0006]定义：本专利技术中的“超速PCR”指通过两个温控体系完成一个循环，进而完成PCR的扩增，区别于常规PCR中由退火、复性、延伸三步骤完成一个循环的PCR扩增方法，同时在常规意义理解上超速PCR用时要短于普通PCR方法。
[0007]本专利技术中的“G-多联体”指被胡斯特氢键稳定的、能够形成富含鸟嘌呤的多层构象的功能核酸高级构象。“G-多联体”可以是G-二联体、G-三联体、G-四联体，还可以是5'-GGTTGGTGTGG-3'。本专利技术中的“G-多联体”以及“G-二联体”、“G-三联体”、“G-四联体”均指能
够与氯高铁血红素（hemin）结合发生显色反应的由氢键稳定、富含鸟嘌呤的多层构象功能核酸。
[0008]G-二联体结构可以为：Y-（G）n-α-（G）n-Z；Y表示0-2个核苷酸残基，α表示1-3个核苷酸残基,Z表示0-3个核苷酸残基；n表示鸟嘌呤的数量，n值为2或3。
[0009]G-三联体结构可以为：Y-（G）n-α-（G）n-β-（G）n-ZY表示0-2个核苷酸残基，α和β表示1-3个核苷酸残基,Z表示0-3个核苷酸残基；n表示鸟嘌呤的数量，n值为2或3。
[0010]G-四联体结构可以为：Y-（G）n-α-（G）n-β-（G）n-γ-（G）n
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ZY表示0-2个核苷酸残基， α、β和γ表示1-3个核苷酸残基,Z表示0-3个核苷酸残基；n表示鸟嘌呤的数量，n值为2或3。
[0011]上述G-二联体、G-三联体、G-四联体的具体结构说明仅作为举例，并不作为对G-二联体、G-三联体、G-四联体具体结构的限制。
[0012]本专利技术中的“核苷酸残基”指常规的核苷酸残基，如A、T、C、G、U等，也包括经过修饰而不影响与显色剂结合、不影响序列特异性的其他核苷酸残基。
[0013]本专利技术中的“特异性引物序列”为依据靶标设计的特异性引物，能够和靶标的对应序列完全互补，也可以基本互补；“基本互补”是指引物与靶标对应序列可以有若干个碱基的差异，但仍能特异性结合靶标；“若干个碱基的差异”包括若干碱基的缺失、增加、替换等。
[0014]本专利技术中的“连接臂”为可抑制聚合酶结合的结构和/或可抑制体外核酸扩增反应过程中新链延伸的结构；具体的，连接臂可以为oxyethyleneglycol，oxyethyleneglycol的化学结构为：。
[0015]本专利技术为了克服现有通过PCR扩增的核酸检测耗时长，需配用设备要求高，操作精度控制严格，成本高等缺陷，提供一种基于超速PCR与功能核酸的可视化检测方法。
[0016]另一方面，本专利技术的超速PCR可视化核酸快速检测方法，为了提高超速PCR的检测靶标范围，延长靶标序列长度和检测精度，进一步进行改进。
[0017]1、本专利技术的一个实施方式是提供一种超速PCR可视化核酸快速检测方法，其特征在于使用超速PCR方法扩增靶标序列，并包括显色反应；PCR反应体系中包括上游引物、下游引物；所述上游引物包括：序列A、连接臂和特异性引物序列B的核苷酸序列；所述下游引物包括：序列A
’
、连接臂和特异性引物序列B
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的核苷酸序列；所述连接臂位于所述序列A/A
’
和特异性引物序列B/B
’
之间，所述特异性引物序列B或B
’
位于上、下游引物的3
’
端，与对应靶标
互补或基本互补；所述连接臂包括可抑制聚合酶结合的结构和/或可抑制体外核酸扩增反应过程中新链延伸的结构；序列A或序列A
’
是G-多联体的一种；序列A与序列A
’
可以相同或不同；所述序列A与所述特异性引物序列B的核苷酸序列有部分互补和/或反向互补，所述序列A
’
与所述特异性引物序列B
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的核苷酸序列有部分互补和/或反向互补；当检测体系中不存在检测靶标时，所述上游引物和下游引物经过超速PCR的热循环过程、可各自形成发卡结构，无法发生显色反应；当检测体系中存在检测靶标时，所述上游引物和下游引物经过超速PCR的热循环过程，经过退火解链后暴露序列A或A
’
的全部或部分序列，从而不再与除DNA聚合酶以外的酶接触，直本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于超速PCR与功能核酸的可视化检测方法，其特征在于使用超速PCR方法扩增靶标序列，并包括显色反应；PCR反应体系中包括上游引物、下游引物；所述上游引物包括：序列A、连接臂和特异性引物序列B的核苷酸序列；所述下游引物包括：序列A
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、连接臂和特异性引物序列B
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的核苷酸序列；所述连接臂位于所述序列A/A
’
和特异性引物序列B/B
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之间，所述特异性引物序列B或B
’
位于上、下游引物的3
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端，与对应靶标互补或基本互补；所述连接臂包括可抑制聚合酶结合的结构和/或可抑制体外核酸扩增反应过程中新链延伸的结构；序列A或序列A
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是G-多联体的一种；序列A与序列A
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可以相同或不同；所述序列A与所述特异性引物序列B的核苷酸序列有部分互补和/或反向互补，所述序列A
’
与所述特异性引物序列B
’
的核苷酸序列有部分互补和/或反向互补；当检测体系中不存在检测靶标时，所述上游引物和下游引物经过超速PCR的热循环过程、可各自形成发卡结构，无法发生显色反应；当检测体系中存在检测靶标时，所述上游引物和下游引物经过超速PCR的热循环过程，经过退火解链后暴露序列A或A
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的全部或部分序列，从而不再与除DNA聚合酶以外的酶接触，直接与显色剂反应显色。2.根据权利要求1所述的检测方法，其技术特征在于，所述显色反应是在氯高铁血红素hemin的诱导下，催化2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺盐ABTS
2-与过氧化氢H2O2生成使反应液呈蓝绿色的物质ABTS-；所述连接臂为oxyethyleneglycol，oxyethyleneglycol的化学结构为：,所述PCR反应体系中使用KAPA2G FAST DNA聚合酶。3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，靶标序列长度可以是80bp以上或600bp以上，还可以是50-5000bp或600-3000bp； PCR反应的反应过程包括： 95-98℃，0-30s；50-60℃，0-20s，共25-40个循环；更具体的可以是95-98℃，0-5s；50-60℃，0-5s，共25-40个循环。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系中，还可以包含纳米金颗粒；优选的，包含0.01-20μM的上游引物、0.01-20μM的下游引物、0.01-50 U/μL的聚合酶、0.01-10nM的金纳米颗粒；更优选的，含有1-5μM的上游引物、1-5μM的下游引物、1-5 U/μL的聚合酶、0.1-0.5 nM的金纳米颗粒；更优选的，含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：许文涛，黄昆仑，田晶晶，李舒婷，杜再慧，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：