通过检测BCAN基因区域的甲基化状态筛查大肠瘤的方法和试剂盒技术

本申请公开了一种在个体中诊断大肠瘤、筛查大肠瘤形成或形成的倾向或监测大肠瘤进展或预后的方法和试剂盒。具体地，本申请通过检测生物样品中BCAN基因区域的甲基化状态来诊断大肠瘤、筛查大肠瘤形成或形成的倾向或监测大肠瘤进展或预后。大肠瘤进展或预后。大肠瘤进展或预后。

【技术实现步骤摘要】
通过检测BCAN基因区域的甲基化状态筛查大肠瘤的方法和试剂盒


[0001]本申请涉及肿瘤筛查领域，具体涉及通过检测生物样品中目标基因的甲基化状态来筛查大肠瘤的方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]结直肠癌是全球第三位常见恶性肿瘤，也是我国常见恶性肿瘤。根据疾病的发展阶段，结直肠癌被分为I-IV期。对于IV期结直肠癌患者，总体生存率非常低，5年生存率不足10％。而I期的患者能达到90％以上的生存率。因此，为了改善肠癌的整体预后，早期诊治显得至关重要。
[0003]现阶段，中国的大肠癌筛查技术主要包括粪便隐血试验、肿瘤标记物检测和肠镜检查。虽然结肠镜检查仍然是确诊肠癌的根本方法，但其高昂的费用、较差的可依从性以及可能的致伤性使得结肠镜难以大规模应用于无症状人群的筛查。粪便隐血试验和肿瘤标记物(例如，外周血癌胚抗原)检测虽然易被接受，但其较差的灵敏度和特异度也给肠癌早期诊治带来了挑战。
[0004]近年来，发现肠上皮细胞内的表观遗传学和遗传学的改变可能有助于结直肠癌的诊断。目前，Septin9基因甲基化已经拥有了一些商业化试剂盒。综合检测BMP3和NDRG4基因甲基化以及KRAS和β-actin基因突变的试剂盒也已经在美国上市。但是一些现有试剂盒存在的问题是结直肠癌的检测效率有待进一步提高。研究者们也在探索其他检测的基因，但所能达到的肿瘤诊断灵敏度和特异性差别较大，且都难以达到大规模筛查的使用要求。
[0005]因此需要灵敏度和特异性更高的大肠瘤筛查方法和试剂盒。
[0006]专利技术简述<br/>[0007]在一个方面，本申请提供了一种在个体中诊断大肠瘤、筛查大肠瘤形成或形成的倾向或监测大肠瘤进展或预后的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中检测BCAN基因区域的甲基化状态，并且将检测到的BCAN基因区域的甲基化状态与BCAN基因区域的正常甲基化状态进行比较，其中相对于BCAN基因区域的正常甲基化状态而言，在来自所述个体的生物样品中检测到的BCAN基因区域的甲基化状态改变表示所述个体患有大肠瘤，或者所述个体有大肠瘤形成或形成的倾向，或者所述个体有大肠瘤发展或发展的倾向，或者所述个体有大肠瘤预后不良或预后不良的倾向。
[0008]在一些实施方案中，相对于BCAN基因区域的正常甲基化状态而言，在来自所述个体的生物样品中检测到的BCAN基因区域的较高甲基化状态表示所述个体患有大肠瘤，或者所述个体有大肠瘤形成或形成的倾向，或者所述个体有大肠瘤发展或发展的倾向，或者所述个体有大肠瘤预后不良或预后不良的倾向。
[0009]在另一个方面，本申请提供了一种监测个体对大肠瘤治疗的应答的方法，所述方法包括在所述个体接受大肠瘤治疗之前和之后分别在来自所述个体的生物样品中检测BCAN基因区域的甲基化状态，其中相对于接受大肠瘤治疗之前的BCAN基因区域的甲基化状
态而言，所述个体在接受大肠瘤治疗之后的BCAN基因区域的甲基化状态改变表示所述个体对大肠瘤治疗有应答。
[0010]在一些实施方案中，相对于接受大肠瘤治疗之前的BCAN基因区域的甲基化状态而言，所述个体在接受大肠瘤治疗之后的BCAN基因区域的较低甲基化状态表示所述个体对大肠瘤治疗有应答。
[0011]在一些实施方案中，所述BCAN基因区域包括：a)Hg19坐标chr1:156611182-156629324及其上游5kb和下游5kb限定的区域；或b)上述a)所列区域经亚硫酸氢盐转化后的对应区域；或c)上述a)所列区域经甲基化敏感限制酶(MSRE)处理后的对应区域。
[0012]在一些实施方案中，所述BCAN基因区域选自下组：a)Hg19坐标chr1:156611182-156629324及其上游5kb和下游5kb限定的区域；或b)上述a)所列区域经亚硫酸氢盐转化后的对应区域；或c)上述a)所列区域经甲基化敏感限制酶(MSRE)处理后的对应区域。
[0013]在一些实施方案中，所述检测BCAN基因区域的甲基化状态包括在来自所述个体的生物样品中测定BCAN基因区域的一个或多个CpG位点中的胞嘧啶残基的甲基化状态。在一些实施方案中，所述BCAN基因区域的甲基化状态包括目标DNA区域的甲基化状态，所述目标DNA区域包括Hg19坐标选自下组的序列：chr1:156611399-156612667、chr1:156616348-156617162、chr1:156626037-156630544和chr1:156611866-156611966，及所述区域的上游200bp和下游200bp的区域，及其任意组合。
[0014]在一些实施方案中，所述生物样品选自组织学切片、组织活检、石蜡包埋的组织、手术切除样本、分离的细胞、体液、结肠流出物，及其任意组合。在一些实施方案中，所述体液选自下组：全血、血清、血浆、尿液、唾液、粘液、腹膜液、胸腔液、胸膜积液、滑液、脑脊髓液、胸腔穿刺液、腹腔积液，及其任意组合。在一些实施方案中，所述结肠流出物选自粪便和灌肠洗涤样品。
[0015]在一些实施方案中，在来自所述个体的生物样品中检测BCAN基因区域的甲基化状态之前，进一步包括以下步骤：
[0016](a)从所述个体获取含有DNA的生物样品；
[0017](b)用试剂处理步骤(a)中获取的所述生物样品中的DNA，所述试剂能够区分所述DNA中的甲基化和未甲基化的CpG位点，从而获取处理的DNA。
[0018]在一些实施方案中，所述DNA包括基因组DNA或细胞外游离DNA。在一些实施方案中，所述细胞外游离DNA包括循环肿瘤DNA。
[0019]在一些实施方案中，步骤(b)中的所述试剂为亚硫酸氢盐试剂或甲基化敏感限制酶(MSRE)。在一些实施方案中，所述亚硫酸氢盐试剂选自下组：亚硫酸氢铵、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铝、亚硫酸氢根离子，及其任意组合。在一些实施方案中，所述MSRE选自下组：HpaII酶、SalI酶、酶、ScrFI酶、BbeI酶、NotI酶、SmaI酶、XmaI酶、MboI酶、BstBI酶、ClaI酶、MluI酶、NaeI酶、NarI酶、PvuI酶、SacII酶、HhaI酶，及其任意组合。
[0020]在一些实施方案中，所述检测使用基于扩增的方法、基于杂交的方法、基于测序的方法、或基于限制性酶切的方法。
[0021]在一些实施方案中，所述检测BCAN基因区域的甲基化状态包括使用扩增酶和一组或多组引物扩增所述处理的DNA，以产生至少一种扩增产物或者所述处理的DNA不被扩增，
可选地，所述处理的DNA包括SEQ ID NOs:4-9、11-12所示的核苷酸序列及其任意组合，或选自由SEQ ID NOs:4-9、11-12组成的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述扩增酶包括耐热DNA聚合酶或缺乏5
’-3’
外切酶活性的聚合酶。
[0022]在一些实施方案中，所述扩增是在检测试剂或封闭试剂的存在下进行的。在一些实施方案中，所述检测试剂包括本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在个体中诊断大肠瘤、筛查大肠瘤形成或形成的倾向或监测大肠瘤进展或预后的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中检测BCAN基因区域的甲基化状态，并且将检测到的BCAN基因区域的甲基化状态与BCAN基因区域的正常甲基化状态进行比较，其中相对于BCAN基因区域的正常甲基化状态而言，在来自所述个体的生物样品中检测到的BCAN基因区域的甲基化状态改变表示所述个体患有大肠瘤，或者所述个体有大肠瘤形成或形成的倾向，或者所述个体有大肠瘤发展或发展的倾向，或者所述个体有大肠瘤预后不良或预后不良的倾向。2.根据权利要求1所述的方法，其中相对于BCAN基因区域的正常甲基化状态而言，在来自所述个体的生物样品中检测到的BCAN基因区域的较高甲基化状态表示所述个体患有大肠瘤，或者所述个体有大肠瘤形成或形成的倾向，或者所述个体有大肠瘤发展或发展的倾向，或者所述个体有大肠瘤预后不良或预后不良的倾向。3.一种监测个体对大肠瘤治疗的应答的方法，所述方法包括在所述个体接受大肠瘤治疗之前和之后分别在来自所述个体的生物样品中检测BCAN基因区域的甲基化状态，其中相对于接受大肠瘤治疗之前的BCAN基因区域的甲基化状态而言，所述个体在接受大肠瘤治疗之后的BCAN基因区域的甲基化状态改变表示所述个体对大肠瘤治疗有应答。4.根据权利要求3所述的方法，其中相对于接受大肠瘤治疗之前的BCAN基因区域的甲基化状态而言，所述个体在接受大肠瘤治疗之后的BCAN基因区域的较低甲基化状态表示所述个体对大肠瘤治疗有应答。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述BCAN基因区域包括：a)Hg19坐标chr1:156611182-156629324及其上游5kb和下游5kb限定的区域；或b)上述a)所列区域经亚硫酸氢盐转化后的对应区域；或c)上述a)所列区域经甲基化敏感限制酶(MSRE)处理后的对应区域。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测BCAN基因区域的甲基化状态包括在来自所述个体的生物样品中测定BCAN基因区域的一个或多个CpG位点中的胞嘧啶残基的甲基化状态，可选地，所述BCAN基因区域的甲基化状态包括目标DNA区域的甲基化状态，所述目标DNA区域包括Hg19坐标选自下组的序列：chr1:156611399-156612667、chr1:156616348-156617162、chr1:156626037-156630544和chr1:156611866-156611966，及所述区域的上游200bp和下游200bp的区域，及其任意组合。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自组织学切片、组织活检、石蜡包埋的组织、手术切除样本、分离的细胞、体液、结肠流出物，及其任意组合。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述体液选自下组：全血、血清、血浆、尿液、唾液、粘液、腹膜液、胸腔液、胸膜积液、滑液、脑脊髓液、胸腔穿刺液、腹腔积液，及其任意组合。9.根据权利要求7所述的方法，其中所述结肠流出物选自粪便和灌肠洗涤样品。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在来自所述个体的生物样品中检测BCAN基因区域的甲基化状态之前，进一步包括以下步骤：(a)从所述个体获取含有DNA的生物样品；(b)用试剂处理步骤(a)中获取的所述生物样品中的DNA，所述试剂能够区分所述DNA中的甲基化和未甲基化的CpG位点，从而获取处理的DNA。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述DNA包括基因组DNA或细胞外游离DNA。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述细胞外游离DNA包括循环肿瘤DNA。13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的所述试剂为亚硫酸氢盐试剂或甲基化敏感限制酶(MSRE)。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述亚硫酸氢盐试剂选自下组：亚硫酸氢铵、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铝、亚硫酸氢根离子，及其任意组合。15.根据权利要求13所述的方法，其中所述MSRE选自下组：HpaII酶、SalI酶、酶、ScrFI酶、BbeI酶、NotI酶、SmaI酶、XmaI酶、MboI酶、BstBI酶、ClaI酶、MluI酶、NaeI酶、NarI酶、PvuI酶、SacII酶、HhaI酶，及其任意组合。16.根据权利要求1-15任一所述的方法，其中所述检测使用基于扩增的方法、基于杂交的方法、基于测序的方法、或基于限制性酶切的方法。17.根据权利要求10-16中任一项所述的方法，其中所述检测BCAN基因区域的甲基化状态包括使用扩增酶和一组或多组引物扩增所述处理的DNA，以产生至少一种扩增产物或者所述处理的DNA不被扩增，可选地，所述处理的DNA包括SEQ ID NOs:4-9、11-12所示的核苷酸序列及其任意组合，或选自由SEQ ID NOs:4-9、11-12组成的核苷酸序列。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述扩增酶包括耐热DNA聚合酶或缺乏5
’-3’
外切酶活性的聚合酶。19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述扩增是在检测试剂或封闭试剂的存在下进行的。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述检测试剂包括可检测的标记物标记的寡核苷酸探针，和/或所述封闭试剂包括不能被聚合酶延长的封闭寡核苷酸。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述寡核苷酸探针包含能够与所述扩增产物杂交的序列，和/或封闭寡核苷酸包含能够与所述扩增产物以甲基化特异性的方式杂交的序列。22.根据权利要求17-21中任一项所述的方法，其中所述引物是甲基化特异性的引物。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述引物包含与所述处理的DNA中对应于BCAN基因区域序列的至少9个连续核苷酸的序列基本互补或基本相同的序列，其中所述连续核苷酸包含至少一个CpG、TpG或CpA二核苷酸，或者其中所述扩增产物包含至少一个CpG、TpG或CpA二核苷酸。24.根据权利要求17-23中任一项所述的方法，其中所述引物包含与选自SEQ ID NOs:1-12的序列的至少9个连续核苷酸的序列基本互补或基本相同的序列。25.根据权利要求17-24任一所述的方法，其中所述引物选自下组：GGGAAGAAAGGGGGTTTTGT(SEQ ID NO:13)BCAN上游引物序列TACGACGAAAACTACGCGAA(SEQ ID NO:14)BCAN下游引物序列和/或，所述寡核苷酸探针选自下组：CGTCGGGAGGGTCGG(SEQ ID NO:15)BCAN探针序列26.根据权利要求17-25任一所述的方法，其中基于所述扩增产物是否存在及其性质，确定所述BCAN基因区域的甲基化状态。27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测或确定BCAN基因区域的甲
基化状态包括使用聚合酶链式反应(例如实时聚合酶链式反应、数字聚合酶链式反应)、核酸测序、基于质量的分离(例如电泳法、质谱法)或靶标捕获(例如微阵列)。28.根据权利要求26所述的方法，其中所述确定包括对所述扩增产物进行测序。29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述BCAN基因区域的正常甲基化状态代表在来自未患有大肠瘤的个体，或者来自没有大肠瘤形成或形成的倾向的个体，或者来自没有大肠瘤发展或发展的倾向的个体，或者来自有大肠瘤预后良好或者预后良好的倾向的个体中所述BCAN基因区域的甲基化状态。30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述大肠瘤是结直肠瘤。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述结直肠瘤是结直肠癌、结直肠腺瘤或无蒂锯齿状息肉。32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述大肠瘤是癌前的。33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述个体是人。34.一种用作检测工具的寡核苷酸，其包含BCAN基因区域或其互补序列的至少9个连续核苷酸或者由BCAN基因区域或其互补序列的至少9个连续核苷酸组成。35.一种用作检测工具的寡核苷酸，其包含BCAN基因区域的经处理的DNA序列或其互补序列的至少9个连续核苷酸，或者由BCAN基因区域的经处理的DNA序列或其互补序列的至少9个连续核苷酸组成，所述处理适于将BCAN基因区域中的至少一个未甲基化的胞嘧啶残基转变为尿嘧啶残基、...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘蕊，王辉，
申请(专利权)人：上海鹍远健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：